DNA İzolasyonu Protokolü (Bakteriden)

Bakteriden spin-column ile DNA izolasyonu

Kullanılacak Ticari Kitler:

• Buffer A

• Buffer B

• Buffer C (guanidin HCl içerir)

• Buffer D (guanidin HCl içerir)

• Elution Buffer (başlamadan önce 60-70 derece sıcaklıkta ısıtın)

• Lizozim

• Filtre Tüpü

• Toplama Tüpü

Gereken Materyaller:

• Absolute etanol

• Absolute izopropanol

• Mikrosantrifüj tüpleri

• Mikrosantrifüj cihazı

• Isı bloğu

Protokol:

1. 200 uL bakteri kültürünü 1.5 mL santrifüj tüpüne alın ve 2.000 rpm'de 5 dakika santrifüj ederek hücreleri çöktürün. Çökme sonrasında oluşan süpernatantı uzaklaştırın.

2. Hücreleri 200 uL Buffer A içerisinde tekrar süspanse hale getirin ve üzerine 10 uL lizozim çözeltisi ekleyin. Ardından tüpü, 37 derecede 15 dakika boyunca inkübe edin.

3. İnkübasyon bitince tüpe 200 uL Buffer B ve 100 uL izopropanol ekleyerek iyice karıştırın.

4. Bir adet filtre tüpünü, toplama tüpü içerisine yerleştirin ve karışımınızı bu filtre tüpüne transfer edin. 10.000 rpm'de bir dakika santrifüj edin.

5. Filtre tüpünü toplama tüpünden ayırın, toplama tüpündeki sıvıyı dökerek uzaklaştırın. Filtre tüpnü tekrar toplama tüpüne yerleştirin ve içerisine 300 uL Buffer C ekleyin. Kolonu 10.000 rpm'de bir dakika santrifüj edin.

6. Filtre tüpünü toplama tüpünden ayırın, toplama tüpündeki sıvıyı dökerek uzaklaştırın. Filtre tüpünü tekrar toplama tüpüne yerleştirin ve filtre tüpünün içerisine 200 uL Buffer D ekleyin. Kolonu, 10.000 rpm'de bir dakika santrifüj edin.

7. Filtre tüpünü toplama tüpünden ayırın, toplama tüpündeki sıvıyı dökerek uzaklaştırın. Filtre tüpünü, toplama tüpüne tekrar yerleştirin ve içerisine 200 uL Buffer D ekleyin. Kolonu 10.000 rpm'de bir dakika santrifüj edin.

8. Filtre tüpünü toplama tüpünden ayırın ve 1.5 mL'lik yeni bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre tüpüne 100 uL Elution Buffer(önceden ısıtılmış) ekleyin ve 10.000 rpm'de bir dakika santrifüj edin.

9. Filtre tüpünü atın, 1.5 mL mikro santrifüj tüpündeki sıvı DNA içermektedir. Sonraki analizler için 4 ila 8 derece arasında kısa süreli, -15 ve -20 derece arasında ise uzun süreli saklama yapılabilir.

Sorun Giderme (Troubleshooting)

Sorun:

Düşük DNA eldesi ya da saflığı.

Çözüm:

• Kit yanlış sıcaklık koşullarında saklanmış olabilir,

• Lizozimalikotları -20 derecede saklanmalı.

Sorun:

Parçalanmış DNA.

Çözüm:

• Nükleaz aktivitesi: Örnekler uygun koşullarda saklanmalı, izolasyon için taze kültür kullanılmalı, reaktifler doğru hacimde eklenmiş olmalı, steril ve DNaz içermeyen sarf malzemeler kullanılmalı

.

Kaynak:

• AMBRD Laboratories, İstanbul, Türkiye