RNA İZOLASYONU PROTOKOLÜ

Biyolojik örneklerden (kan, doku, tükürük,organ vb.) elde edilen hücrelerin, hücre zarı kimyasal maddeler ve enzimlerle parçalanıp, daha sonra adım adım protokollerle ortamda sadece RNA'ların kalmasına kadar saflaştırma işlemidir. RNA izolasyonu protokolü dokuya ve numunelere göre farklılık gösterirken aşağıda bahsedeceğimiz yöntem doku örnekleri için geçelirdir.

Görselde belirtildiği gibi tavuktan alınan doku örneğinden nasıl RNA izolasyonu yapılacağı adım adım hem İngilizce hem de Türkçe aşağıda yer almaktadır.

RNA İzolasyon Protokolü ( RNA ısolation protocol)

1. Add 1 ml of TRIzol per 30-50 mg of tissue material

(30-50 mg doku örneği için 1 ml TRIzol ekle) (Liziz basamağı) ( parçalama basamağı )

· TRIzol : Doku homojenizasyonunda RNA bütünlüğünde korurken aynı zamanda hücreleri ve hücre bileşenlerinlerini bozup parçalayarak ayrıştırır.

2.Incubate for 5 minutes to permit complete dissociation of the nucleoproteins complex

(Nükleoprotein kompleklerinin tamamen ayrılması için 5 dk inkübe et)

· İnkübe : Trizol eklendikten sonra tüp ters düz edilerek çarkalanır. İnkübenin asıl amacı ortamdaki maddelerin birbirine temas etmesi için uygulanır.

3. Add 0.2 mL of chloroform per 1 mL of TRIzol™ Reagent used for lysis, then securely cap the tube

(Lizizde kullanılan her 1 ml TRIzol için 0.2 ml kloroform ekle, sonrasında tüplerin kapaklarını iyice

kapat)

· Kloroform : Diğer maddelerin çözünmesini yardımcı olan bir maddedir ve genel olarak çözücü olarak kullanılır.

4. Incubate for 2–3 minutes

(2-3 dk inkübe et)

5.Centrifuge the sample for 15 minutes at max speed - room temperature

(Örnekleri, oda sıcaklığında (25 derece) , maksimum hızda 15 dk santrifüjle)

6.Transfer the aqueous phase containing the RNA to a new tube

(RNA’yı içeren sulu fazı (en üstteki faz) yeni bir tüpe aktar) (Dikkatli bir şekilde yapılmalı!)

· Bu işlem yapılırken çok dikkatli olup alttaki ve üstteki faz karıştırılmadan birbirine karışmayacak şekilde ayrılmalıdır. Aksi taktirde fazlar birbirine karışırsa RNA yapısında kirlenme meydana gelir ve saflık ve konsantrasyonda saptırıcı rakamlar ortaya çıkar.

· Süpernatant ( alttaki atılacak kısım ) içerisinde iyonlar, tuzlar, hücre bileşenleri ve protein vs bulunmaktadır.

7 Add 0.5 mL of isopropanol to the aqueous phase, per 1 mL of TRIzol™ Reagent used for lysis

(Lizizde kullanılan her 1 ml TRIzol için, sulu faza 0.5 ml isopropanol ekle)

· İzopropanol küçük hacimlerde %100 lük saf soğuk Etoh (etanol) dan daha iyi sonuçlar verir RNA konsantrasyonunda izopropanol daha sağlıklı verilere ulaşmamızı sağlar.

Alkol uçarak uzaklaşırken İzopropanol etanole göre ortamdan daha yavaş uzaklaşır.

İzopropanol genel olarak RNA çöktürme işleminde kullanılır.

8.Incubate for 10 minutes

(10 dk inkübe et)

9.Centrifuge for 10 minutes at max speed at room temperature

(Oda sıcaklığında, maksimum hızda 10 dk santrifüjle)

10. Discard the supernatant with a pipette

(Supernatant’ı pipet kullanarak uzaklaştır)

· Süpernatant : RNA içermeyen içerisinde tuz ve sulu faz bulunun kısım.

11.Resuspend the pellet in 1 mL of 75% ethanol per 1 mL of TRIzol used for lysis

(Lizizde kullanılan her 1 ml TRIzol için, pellet’i 1 ml 75%’lik etanol (etil alkol) ile çöz)

· %75 lik etanol : RNA’nın yıkanması amacıyla kullanılır. RNA ya bağlı tuzların ortamdan uzaklaşmasını sağlar.

12.Vortex the sample briefly then centrifuge for 5 minutes at max speed at room temperature

(Örnekleri kısaca vorteksle, sonra oda sıcaklığında maksimum hızda 5 dk santrifüjle)

· Vorteks: Makinesi vardır, tüp içerisindeki bileşenleri daha iyi homojenizede eder.

13.Discard the supernatant with a pipette

(Supernatant’ı pipet kullanarak uzaklaştır)

14.Vacuum or air dry the RNA pellet for 5–10 minutes

(RNA pelletlerini 5-10 dk havada ya da vakumla kurut / alkolü uzaklaştır )

15. Resuspend the pellet in 20–50 µL of RNase-free water by pipetting up and down

(Pelleti 20-50 ul RNAaz-içermeyen su ile pipetleyerek çöz)

· RNAaz içermeyen su : RNAaz RNA yı parçalan enzimdir bu yüzden bu enzimi içermeyen saf su kullanılır.

16. 1Determine RNA concentration using the nanodrop

(RNA konsantrasyonunu, Nanodrop kullanarak belirle)

An absorbance of 1 unit at 260 nm corresponds to 40 µg of RNA per ml (A260 = 1 = 40 µg/ml)

260 nm dalga boyundaki 1 birim absorbans, 40 µg/ml RNA’ya karşılık gelir.

A ratio of ~1.8 is generally accepted as “pure” for DNA; a ratio of ~2.0 is generally accepted as “pure” for RNA.

Doğukan SEVGİ

21.02.2022

( Çağlar BERKEL' e katkılarından dolayı teşekkür ederiz. )

Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi