Bakteriyel Plasmid DNA İzolasyonu

Bakteriyel plasmid DNA izolasyonu, bakteri hücrelerinden plasmid DNA'nın yalnızca diğer hücre içi moleküllerden (lipidler, proteinler, vb.) değil, genomik DNA ve RNA gibi diğer nükleik asitlerden de ayrıştırılarak saf bir biçimde elde edilmesini sağlayan yöntemlerden oluşmaktadır.

Alkalin lizis yöntemi, düşük miktarlardaki (miniprep) plasmid DNA'nın hızlı ve güvenilir biçimde elde edilmesini kolaylaştıran bir yöntemdir. Bu yöntemde genomik DNA ve plasmid DNA, birbirinden denatürasyon ve renatürasyon özelliklerine göre ayrışmaktadır.

Alkalin lizis yöntemine geçmeden önce ilk aşamada, kültür ortamından seçilen 1 tane koloni, 3-5 mL'lik LB broth içerisinde seçici bir antibiyotik varlığında (ampisilin gibi) 1 gece inkübe edilir. İnkübasyon tamamlandığında, bakterileri içeren broth ortamı santrifüj edilir ve hücrelerin tüpün dibinde pelet halinde elde edilmesi sağlanır. Pelet üzerine plasmid izolasyonunda kullanılan tampon sistemleri ilave edilerek alkalin lizis yöntemine başlanır ve hücre duvarına sahip bakterilerin sferoblast adı verilen çeperden yoksun hücrelere dönüşmesi sağlanır. Bu tampon içerisinde genellikle pH dengeleyici Tris, divalent katonları bağlayarak membranın destabilixe olmasına ve DNaz'ların inaktif edilmesine yardımcı olan EDTA, hücrelerin deneyin başlangıcında osmalarite dengesinin bozulmadan parçalanmalarını önlemek ve dolayısıyla hücresel DNA'nın ortama karışarak yeterli miktar izole edilememesini engellemek adına glukoz, RNaz gibi RNA degrade edici enzimler ve hücre duvarını parçalayan lizozim enzimleri bulunabilmektedir.

Ardından bakterilerin lizis edilmesi amacıyla, ortama güçlü bir baz olan NaOH ve plazma membranın parçalanmasından sorumlu SDS eklenir. Yüksek konsantrasyondaki NaOH, alkalin (bazik) şartlar oluşturarak (pH~11) genomik DNA'nın ve plasmid DNA'nın denatüre hale (tek zincirli) geçmesine neden olur. Bakterilerin genomik DNA'sı denatürasyonun ardından lineerleşir, birbirinden uzaklaşır ve çok uzun olduklarından renatüre olmaları zordur. Ancak, plasmid DNA denatüre olsa bile yapıları gereği zincirler, birbirine yakın vaziyette kalır. Ardından, yüksek potasyum asetat konsantrasyonuna ve asetik asite sahip nötralizasyon solüsyonu ortama dahil edilerek, bazik olan ortam nötralleştirilir ve böylece plasmid DNA'ların tekrar renatüre hale geçmesi sağlanır. Ortamda halihazırda bulunan SDS, potasyum asetat birlikte kullanıldığında santrifüj sonrası büyük ve lineer hale geçmiş genomik DNA'nın ve protein gibi diğer kontaminantların tüpün dibine çökmesini kolaylaştırırken, renatüre hale gelen plasmidler hala süpernatant içerisinde kalmaktadır.

Süpernatanttan plasmidleri ayrıştırmak için ise saf alkol (izopropanol, etanol gibi) ya da tuz (NaCl gibi) kimyasallar ile çöktürme işlemi yapılır. Pelet halinde çöken plasmidler yıkama ve çözdürme aşamasıyla saf bir biçimde elde edilebilir. Bu yöntemlere ek olarak, silica tabanlı column tüpler kullanılarak da plasmid ayrıştırması yapılabilir. Özellikle yüksek tuzlu ve düşük pH'lı ortamlarda DNA'nın silica matrikse bağlanması sağlandığından süpernatantta bulunan diğer bileşenler rahatlıkla elemine edilebilir. Son adımda, elüsyon tamponu yardımıyla plasmidler matriksten ayrıştırılarak mikrosantrifüj tüpünde çözünmüş halde elde edilir.

Kısacası alkalin lizis yönteminin genel adımları:

1. 1 tane koloniden seçici antibiyotik içeren ortamda gece kültürü hazırlanması

2. Ertesi gün hücrelerin santrifüj edilerek pelet halinde toplanması

3. Tamponlar yardımıyla hücrelerin tekrar resüspanse hale getirilmesi

4. Hücrelerin lizis edilmesi ve NaOH yardımıyla DNA'ların denatüre hale getirilmesi

5. Plasmid DNA'ların asetik asit ve potasyum asetat ile renatürasyonu ve genomik DNA'dan ayrıştırılması

6. Alkol ile plasmid DNA'nın presipitasyonu + yıkanması + çözünmesi ya da silica-tabanlı column'a aktarımı + elüsyonu.