Bitkilerden Spin-Column İle DNA İzolasyonu Protokolü

Bitki örneklerinden DNA izolasyonu

Kit İçeriği:

• RNase A (10mg/ml)

• PCL soltion (bitki hücresi lizis solüsyonu)

• PP solution

• PB solution

• Wash solution

• Elution buffer

• EZ-10 spin column

• Collection column

Kit içerisinde yer almayan gerekli sarf malzemeler:

• Mikropipet ucu

• Mikrosantrifüj tüpleri

• Havan

• Buz

Gerekli cihazlar:

• Mikrosantrifüj cihazı

• Isı bloğu

• Buz makinesi

• Vorteks cihazı

• Mikropipet

Protokol:

1. İzolasyon öncesinde bitki örneklerini sıvı nitrojen ile doldurun ve havanda ezerek fiziksel olarak parçalayın. Parçalama sonrası, toz haline gelmiş bitki partiküllerini 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

2. Toz halindeki bitkinin kapladığı hacim kadar mikrosantrifüj tüpü içerisine PCL solüsyonu ekleyin (yaklaşık 150 uL kadar).

3. Tüpü birkaç kere vorteksleyin ve 65 derecede 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonunda içeride büyük bitki parçaları kalmaması için vorteks tekrar edilebilir.

4. Ardından tüpe 25 uL PP solüsyonu ekleyin ve tüpü buz üzerinde 15 dakika bırakın.

5. Ardından 10.000 rpm'de 4 derecede 5 dakika santrifüj edin. Santrifüj sonrası sıvı kısmı (süpernatantı) mikropipetle toplayarak EZ-10 spin-column'a transfer edin.

6. Spin-column içerisine ek olarak 300 uL PB tamponu ekleyin ve tüpü yavaşça birkaç defa ters-düz çevirerek karıştırın. Ardından, 3 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bu süreçte ara sıra tüp ters düz edilebilir.

7. Spin-column'u 4 derecede, 10.000 rpm'de 2 dakika santrifüj edin.

8. Collection column'a geçen sıvıyı çöpe boşaltın. Spin-column' içerisine ise 150 uL Washing solution ekleyin ve 10.000 rpm'de 2 dakika santrifüj edin. Santrifüj sonrası dibe çöken sıvıyı boşaltın.

9. 8. aşamayı tekrarlayın.

10. Collection column'daki sıvıyı tekrar boşaltın ve spin-column'a herhangi bir sıvı eklemeden 1 dakika 10.000 rpm'de tekrar santrifüj gerçekleştirin. Böylelikle column'da kalan diğer buffer'ların tamamı uzaklaşacaktır.

11. Spin-column'u collection column'dan çıkarın ve steril bir mikrosantrifüj tipine yerleştirin. Column'un içerisindeki filtrenin ortasına 40 uL Elution buffer ekleyin ve 37-50 derecede 2-3 dakika inkübe edin.

12. DNA elüsyonu için 10.000 rpm'de 2 dakika santrifüj edin. Böylelikle mikrosantrifüj tüpünün dibine çöken sıvı DNA içerecektir.

13. DNA konsantrasyonunu 260 nm'de ölçün ve uzun süreli saklama için DNA örneklerini -20 derecelik dolaba alın.

Kaynak:

• BIO BASIC INC. EZ-10 Spin Column Genomic DNA MiniPreps Kit, Plant. Version 1.0