DNA/Gen Klonlama ve Biyotransformasyon İçin Kullanılan Bileşenler

DNA/Gen Klonlamasında Kullanılan Bileşenler:

• Hedef DNA (İnsert DNA)

• Restriksiyon Enzimleri

• Vektörler

• DNA Ligaz Enzimleri

• Kompetent Bakteri Hücreleri

• Antibiyotikler

İnsert DNA Nasıl Elde Edilir?

Hedeflenen insert DNA'nın elde edilmesinde farklı yöntemlerden yararlanılabilir. Bu yöntemler:

• Hücrelerden direkt olarak DNA'nın izole edilmesini ve ardından istenen bölgenin bir restriksiyon enzimiyle kesilmesi,

• Restriksiyon enzimlerinin kullanımı haricinde istenen bölgenin PCR ile çoğaltılarak spesifik insert DNA'lar elde edilmesini,

• İnsert DNA'nın ticari olarak sentez edilmiş halde satın alınmasını veya

• Bir mRNA'nın ters transkripsiyon ile cDNA formuna dönüştürülüp insert DNA olarak kullanılmasını içerebilir.

Restriksiyon Enzimleri:

İnsert DNA bölgesinin sahip olduğu nükleotid dizisinin bilinmesi doğru restriksiyon enziminin seçilmesi açısından önemlidir. Örneğin; EcoRI enzimi GAATTC - CTTAAG palindromik sekansını tanıyarak kesim yapmakta ve yapışkan uçlara sahip iki DNA fargmanı oluşturmaktadır. İnsert DNA bölgesinde bu palindromik dizinin yer alması EcoRI seçimi ve klonlamanın ikinci adımı olan kesme işlemi için uygundur. Bununla beraber, insert DNA için kullanılan restriksiyon enzimlerinin aynısını vektör DNA'yı kesmek için de kullanmak iki DNA molekülünün birleşmesi için önemlidir. Aynı zamanda, yapışkan uçlara sahip DNA molekülleri küt uçlu DNA moleküllerine kıyasla çok daha kolay biçimde vektöre entegre olmaktadır.

Vektörler:

Çeşitli tipte klonlama vektörleri bulunur. Bu vektörler insert DNA'nın kompetent hücre içerisine girmesini sağlar. Yani bir vektör, üzerine entegre edilen insert DNA'yı taşıyan ve insert'ün replikasyonunu sağlayan moleküldür. Doğru vektör seçilirken:

• Konak için ne kadar özgül olduğunun

• Ne kadar büyüklükte bir insert'ü taşıyabileceğini

• Kaç kere replikasyona uğrayabileceğinin ve

• Hangi marker genlerine sahip olduğunun bilinmesi önemlidir.

Klonlamada sıklıkla kullanılan vektörler:

• Plasmid vektörleri

• Bakteriyofaj vektörleri

• Virüs vektörleri

• Shuttle vektörleri

• Maya ya da bakteri yapay kromozom vektörleridir.

Plasmid Vektörleri:

Plasmidler, doğal olarak bakterilerin içerisinde yer alan çift zincirli ve halkasal DNA molekülleridir. Bu moleküller, bakterinin genomik DNA'sından farklıdır. Öyle ki, kendi başlarına replike olabilmekte ve genellikle bakterilerin antibiyotiğe karşı direnç geliştirmesinde görevli genleri ihtiva etmektedir. Plasmid vektörler kendi başlarına replike olabildiklerinden dolayı bakteriyel biyotransformasyon ve DNA klonlama çalışmalarında sıklıkla tercih edilmektedir. Bir plasmidde önemli olan birkaç özellik vardır. Ticari olarak da satılabilen plasmidler, çoklu klonlama bölgeleri (multiple cloning sites-MCS) içerirler. Bu klonlama bölgeleri DNA'yı kesen restriksiyon enzimleri tarafından tanınan spesifik sekanslar içerir. Araştırmacının ilgilendiği insert DNA fragmentleri (genler), bu spesifik sekansların yardımıyla çoklu klonlama bölgelerine aktarılabilirler. Plasmidler ayrıca hücrelere plasmiddeki replikasyonun nereden başlaması gerektiğine dair bilgi veren replikasyon orijini (ORI) içerirler. Replikasyon orijini ve çoklu klonlama (kesim) bölgeleri'ne ek olarak, birçok plasmid, antibiyotik dirençlilik geni de içerir. Bu gen sayesinde, bu plasmide sahip olan tüm hücreler o antibiyotiğe dirençli hale gelir, böylece bu hücreler antibiyotik içeren besiyerinde selektif olarak yaşayabilirler.

pUC18 Vektörü:

pUC18 sıklıkla kullanılan bir plasmid vektörüdür. Yaklaşık 2.7 kb'lık büyüklüğe sahip olup kompetent hücre içerisinde 500 kadar kopyasını oluşturabilir. Bu vektörün üzerinde polylinker adı verilen ve lacZ geni üzerine kümelenmiş restriksiyon enzimleri için uygun kesim bölgeleri yer alır. lacZ polylinker adı verilen bölgenin tamamını kapsayan bir gendir. Polylinker bölgesinde restriksiyon enzimi ile gerçekleşen kesimler ve bu bölge üzerine insert DNA'nın entegrasyonu lacZ geninin yapısını bozarak protein kodlama işlevini bozmaktadır. bu özellik, seçme (görüntüleme) aşamasında rDNA klonlarını içeren doğru kolonilerin seçimini kolaylaştırmaktadır. Eğer insert DNA vektöre entegre olmamışsa, vektör DNA'sında lacZ geni protein kodlama işlevini yerine getirir ve beta galaktozidaz adı verilen bir enzimi üretir Besi ortamında bulunan Xgal isimli bir galaktos bileşiğini parçalayan beta galaktozidaz enzimi kolonilerin mavi renge bürünmesine neden olur. Sonuç olarak mavi renk rDNA klonlarını taşımayan bakteri kolonilerini gösterirken, lacZ geni üzerine insert DNA entegrasyonu olan rDNA klonlarını taşıyan koloniler bu enzimi üretemeyeceğinden Xgal'i parçalayamaz ve beyaz renkli olarak görünür.

DNA Ligaz Enzimleri:

DNA ligaz enzimleri restriksiyon enzimlerinin kesimiyle oluşan yapışkan ya da küt uçlara sahip insert DNA'nın bir vektör DNA'ya takılmasını sağlar. Bu enzimler vektör DNA ve insert DNA uçlarını birbirine kovalent olarak bağlar ve rekombinant DNA molekülünü oluşturur. T4-DNA ligazlar en sık tercih edilen enzimlerdir.

Antibiyotikler:

DNA klonlaması aşamalırında kullanılan bir diğer molekül ise antibiyotiklerdir.

Antibiyotikler, transformasyonun başarılı şekilde gerçekleştiği kolonilerin besi ortamında büyümesine olarak tanır. Örneğin; pUC18 vektöründe yer alan ampisilin direnç geni, bu vektörü taşıyan bakterilerin ampisilin antibiyotiği içeren besi yerinde büyüyebilmesini sağlarken, pUC18'i taşımayan bakteriler bu ortamda büyüyemeden ölürler.

Kompetent bakteri hücreleri:

Klonlanması istenen DNA materyalini (geni) kabul etme yeteneğine sahip hücrelere kompetent hücreler denir. En sık kullanılan hücre prokaryotik bir organizma olan E.coli bakterisinin K12 suşudur. Bu hücreler hızlı bölünebilme ve hızlı replikasyon yeteneklerinden dolayı DNA klonlama çalışmalarında kompetent hücre olarak tercih edilebilmektedir. Bununla beraber, S.cerevisiae gibi maya türü ökaryot bir organizma olarak kompetent hücre olarak kullanılabilmektedir.