Real-Time PCR Analiz Yöntemleri

Real-Time PCR analiz yöntemleri için araştırmacının amacı doğrultusunda iki temel analiz yöntemi ön plana çıkmaktadır.

1. Absolute Quantification (mutlak ölçüm analizi): PCR sonunda elde edilen Ct değerleri, reaksiyon ortamında bulunan DNA ürünlerinin kopya sayısının belirlenmesinde kullanılır.

2. Relative Quantification (göreceli ölçüm analizi): PCR sonunda bir örneğe ait Ct değeri, diğer örneklerdeki Ct değerleriyle birlikte analiz edilerek DNA ürünlerinin farklı gruplardaki miktarı göreceli biçimde kıyaslanır.

Absolute Quantification:

Bu analiz yönteminde, araştırmacılar çalıştıkları reaksiyon ortamında yer alan hedef DNA'nın kaç kopya halinde bulunduğunu analiz etmektedir. Bu amaçla, içerisinde kaç sayıda kopyadan oluştuğu bilinen bir standart DNA ve onun dilüsyonları (normalizör) tarafından oluşturulan bir standart eğri grafiği dizayn edilir. Araştırmacının kopya sayısını bilmediği örnek ise bu standart eğrinin üzerinde matematiksel formüller yardımıyla hesaplanır. Hesaplama sonucunda araştırmacının miktarını araştırdığı örnek kopya sayısı bakımından tespit edilir.

Kullanım alanları:

• Kromozom kopya sayısının,

• Gen kopya sayısının,

• Viral yükün (kandaki viral DNA kopyası vs.) belirlenmesinde kullanılır.

Absolute Quantification - Standart Eğri:

Bir standart eğri oluşturabilmek için, miktarı bilinen DNA örneği belirli oranlarda seyreltilir. Oluşturulan dilüsyonlar ile birlikte miktarı bilinmeyen DNA örneği aynı anda PCR reaksiyonuna tabii tutulur. Kopya sayısı bilinen ve seyreltilmiş DNA örneklerinden elde edilen Ct değerleri kullanılarak bir standart eğri ve bu eğriye ait eğri denklemi elde edilir.

Relative Quantification:

Relative quantification, genellikle gen ifadesi çalışmalarında tercih edilir. Bu yöntemle, iki farklı örnekteki ortak bir genin ifadesinin değişimi (artışı ya da azalışı) incelenir. Bu analiz yönteminde, DNA standardı kullanılarak kopya sayısının belirlenmesine gerek yoktur. Çünkü iki farklı reaksiyon ortamı hedef bir gen için göreceli olarak değerlendirilir. Bu göreceli fark, genellikle fold change (kat değişimi) şeklinde yorumlanır. Hedef bir genin relative analizini yapmak için ilave olarak referans ya da housekeeping adı verilen farklı bir gene daha ihtiyaç duyulur. Relative quantification ile genellikle iki farklı örnekte (tümör-sağlıklı hücre kıyaslaması gibi) belirlenen bir hedef genin ekspresyon miktarı bakımından karşılaştırılması yapılır.

Birim-Kütle Yöntemi (unit-mass):

Referans gen ile normalizasyon yöntemine göre oldukça basit olup, karmaşık matematiksel hesaplamalar gerektirmez. Metodun en önemli önceliği, başlangıç materyalinin miktarı doğru seçilmesi gerekliliğidir. Örneğin, iki farklı hücre kültüründe bir genin ifadesi karşılaştırılacaksa, RNA'nın izole edildiği iki farklı hücre kültüründe başlangıçta eşit sayıda hücre olması gereklidir. Bunun yanı sıra, kullanılan başlangıç materyalinin aynı kütlede (mikrogram) nükleik asit içermesi gereklidir. Ayrıca bu metotta, iki farklı hücre grubundan bir tanesi kalibratör (kontrol) olarak seçilir. Diğer hücre grubunun ise gen ekspresyon profili kalibratördeki gen ekspresyon profiline göre kıyaslanır.

Referans Gen ile Normalizasyon Yöntemi:

Real-Time PCR'da ekspresyonu araştırılan hedef bir gene ilaveten referans bir genin analizi daha gerçekleştirmek, birim-kütle yönteminin oldukça hassas miktarda başlangıç materyali (hücre, RNA) gerektirmesi dezavantajını ortadan kaldırmaktadır. Referans gen ile normalizasyon yöntemi, başlangıç materyali miktarı az ise oldukça hassas bir analiz sağlar. Bununla beraber, bu yöntemin dezavantajlarından birisi sabit düzeyde ifade olan bir referans genin deney öncesinde literatür araştırması yapılarak doğru biçimde seçilmesidir. Ayrıca, referans gen sağlıklı ve tümör hücresinde ya da ilaç uygulanan ve uygulanmayan hücrelerde benzer ekspresyon seviyesi göstermelidir.

Referans/Housekeeping Gen:

Housekeeping ya da refereans genler, Real-Time PCR sonunda elde ettiğimiz verilerin normalizasyonunda kullanılır. Housekeeping genlerinin ekspresyonunu önceden tahmin edebilme kolaylığı, hedef bir genin ekspresyonunu araştırdığımızda kolaylaştırılması mümkün olan deneysel hataların tespitini ve hedef gene ait ifade miktarının yorumlanmasını kolaylaştırır. Bu housekeeping geni referans alınan çalışmada, hedef genin Ct değerlerini housekeeping geninin Ct değerlerine oranlamamız gerekir. Bu yüzden, hangi biyolojik örnekle çalışacaksak daha önce uygun bir literatür taraması yapmalı ve çalışmamıza en uygun housekeeping genini seçmemiz önemlidir.

Housekeeping genler, çoğunlukla bir organizmanın tüm dokularında temel hücresel işlevlerin yerine getirilebilmesi için gerekli bazı proteinlerin ya da RNA'ların kodlanmasını sağlamaktadır. Bundan dolayı, tüm dokularda housekeeping genlerin ifadesi sürekli ve istikrarlı düzeylerde seyretmektedir. Bu durum, housekeeping genlerini doku spesifik genlerden farklı kılmakta ve Real-Time PCR deneyi için araştırmacılara büyük kolaylık sağlamaktadır.