TOPO TA Klonlama

TOPO TA Klonlama Nedir? Nasıl Yapılır? Aşamaları:

TOPO klonlama, PCR tabanlı çalışabilen bir klonlama stratejisidir. PCR ile üretilen insert DNA molekülleri TOPO klonlama vektörüne aktarılır. Bu yöntem ismini Topoizomeraz I (TOPO) adı verilen; çift zincirli DNA'nın negatif süper sarmal yapısını gevşeterek transkripsiyon ve replikasyonun ilerleyişini kolaylaştıran bir enzimden almaktadır. TOPO TA klonlamada Topoizomeraz I enzimi hem bir restriksiyon enzimi hem de bir ligaz enzimi gibi işlev görerek vektör DNA üzerinde kesim yapabilmekte ya da insert DNA'yı vektör DNA'ya yapıştırabilmektedir.

Tipik olarak bir PCR reaksiyonunda hedef bölgenin çoğaltılması özgün olarak tasarlanan primer çiftlerine bağlıdır. Bu yüzden insert DNA adayı olan bölgeye uygun primerler sentezlemek bu gölgenin spesifik olarak elde edilmesine ve çoğaltılmasına yardımcı olmaktadır. PCR reaksiyonlarında sıklıkla kullanılan Taq polimeraz TOPO TA klonlama açısından önemli bir işleve sahiptir. Taq polimeraz oluşan her yeni DNA ürününün 3' uçlarına bir adet deoksiadenozin (A) eklemektedir. Vektör DNA ise 3' uçlarında A bulunan insert DNA ile kolayca birleşecek şekilde dizayn edilmiştir. Bu doğrultuda, vektör DNA halkasal yapı yerine lineer formda bulunur ve bu yapının 3' uçlarında birer deoksitimidin (T) yer alır. Böylelikle insert ve vektör DNA deoksiadenozin - deoksitimidin (A=T) etkileşimi sayesinde birbirine kolayca entegre olurlar. Lineer formdaki vektörün oluşturulmasında kullanılan enzim ise Vaccinia virüsünden izole edilen Topoizomeraz I enzimidir. Topoizomeraz I, DNA üzerindeki 5' -CCCTTT dizilerini tanıyarak kesebilmekte ve halkasal vektör yapısını lineer forma dönüştürmektedir. Ayrıca, vektörün her iki ucundaki deoksitimidin (T) insert DNA'nın her iki ucundaki deoksiadenin (A) ile etkileşildiğinde, topoizomeraz vektör ve insertin birbiriyle kaynaşmasına yardımcı olmakta ve ardından DNA'dan tamamen ayrılmaktadır. TOPO klonlamada kullanılan vektörlerden biri pGEM-T Easy vektörüdür. Koloni seçimi için lacZ geni üzerinde restriksiyon enzimleri için kesim bölgesi dışında 3' zincirin uçlarında birer deoksitimidin rezidüsü bulunur. Bununla beraber, kültür içerisinde vektörü alan stabil hücrelerin belirlenmesini sağlayan amfisilin antibiyotiğine karşı bir direnç geni bulunmaktadır.

Katı Besiyeri:

TOPO klonlama, birçok aşaması olan kompleks bir deneydir. Bu nedenle öncelikle uygun solüsyonların ve besiyerlerinin hazırlanması önemlidir. Bakterilerin kültüre edeceği ortamın hazırlanması:

• Ortam: LB (Luria-Bertani) katı besiyeri.

• Kolonilerin Seçilmesi için: LB ortamına ek olarak, mavi-beyaz koloni ayrımı için X-Gal, LacZ geninin ifadesinin artması için IPTG, besi ortamında vektörü alan bakterileri selektif büyümesi için amfisilin antibiyotiği ortama ilave edilir.

S.O.C. Besiyeri:

S.O.C. besiyeri ise bakteriyel transformasyonun son aşamasında E.coli'nin vektörü alma kapasitesini arttıran sıvı bir ortamdır. Bu ortam yüksek miktarda peptid, amino asit, vitamin ve glukoz içermektedir. Bu özelliğinden dolayı bakteriler için stresli bir işlem olan transformasyon sonrası hücrelerin sağ kalımını olabilecek en üst seviyede devam ettirmektedir. Bu durum haliyle transformasyonun başarısını önemli ölçüde arttırmaktadır.

Vektör ve İnsert DNA'nın Birleştirilmesi:

​Bileşen

Taze PCR ürünü (insert DNA)

Tuz solüsyonu

TOPO vektör

Su

Tabloda gösterilen bileşenler bir tüp içerisinde hazırlanarak yaklaşık 30 dakika kadar oda sıcaklığında inkübasyona bırakıldıklarında vektör ve insert DNA birbirlerine entegre olabilmektedir. Dikkat edilecek bir nokta; inkübasyon öncesi karışımların buz üzerinde hazırlanması gereklidir. Ayrıca, inkübasyon bittikten sonra karışım tekrar buz üzerinde tutulmalıdır. Karışım içerisinde yer alan tuz solüsyonu transformant oluşumunu büyük oranda arttırmaktadır.

Kompetent Hücrelere Aktarım:

Kompetent hücrelere rDNA (insert + vektör DNA) aktarım aşaması transformasyon aşaması olarak da bilinir. Kit içeriğinde kompetent hücreler dondurulmuş halde geldiğinden önce hücreler buz üzerinde yavaşça çözdürülür. Ardından, rDNA'nın oluşturulduğu karışımı içeren tüpten belirli miktarda hacim alınarak kompetent hücrelerin bulunduğu ortama transfer edilir ve bu yeni karışım 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyona bırakılır. 30 dakika sonrası transformasyonun gerçekleşmesi adına ısı şoku muamelesi yapılır. 42 derecedeki su banyosuna kompetent hücre - rDNA karışımını içeren tüpler 30 saniye boyunca bırakılır ve ardından tekrar buz üzerine alınır. Transformasyon işlemi oldukça hassas olduğundan bakteriler üzerinde stres durumu yaratacak yüksek ısı ya da uzun inkübasyon süresi gibi koşullardan kaçınılmalıdır. Bu koşullar aynı zamanda vektör ve insert DNA'yı birbirinden ayrılması için risklidir. Dolayısıyla transformasyon aşamasını iyi bir şekilde organize etmek önemlidir. Ardından, ısı şoku uygulaması sonrası buz üzerine alınan hücrelerin üzerine S.O.C. besiyeri eklenir. Oluşan yeni karışım bakterilerin zengin bir şekilde beslenmesinin yanında katı LB besiyerine aktarımlarını da kolaylaştırmaktadır. S.O.C. içerisinde bakteriler çalkalamalı inkübatörde 37 derecede 1 saat inkübe edildikten sonra LB katı besiyerine aktarılırlar.

Mavi/Beyaz Kolonilerin İncelenmesi:

İnkübasyon süresi bittikten sonra klonlamanın başarılı olduğu kolonilerin seçilmesi aşamasına geçilir. Bu aşamada renk ayrımı gözetmeksizin üreyen tüm kolonilerin teoride vektörü aldığı varsayılmaktadır. Çünkü, katı besiyerinde amfisilin antibiyotiği yer aldığından amfisilin direnç genini içeren vektörü bulundurmayan bakterilerin yaşaması mümkün olmayacaktır. Ancak, deneyin amacı doğrultusunda araştırmacıların görmek istediği sonuç vektör - insert DNA (rDNA) molekülünü alan kolonilerin belirlenmesidir. Bu doğrultuda vektör + insert DNA (rDNA) klonlarını içeren koloniler beyaz renkli kolonilerdir.

Görüntüleme Aşaması:

Beyaz koloniler belirlendikten sonra klon DNA'ların izolasyonun yapılması ve klonların gerçekten oluşup oluşmadığının görüntülenmesi/teyit edilmesi gerekmektedir. Koloniler bir kürdan yardımıyla toplanarak bakterilerden plasmid izolasyonu gerçekleştirilir. Plasmid izolasyonunun ardından elektroforez uygulamaları, PCR, blotlama yöntemleri ve dizi analizi/sekanslama metotlarıyla insert DNA'nın klonlanıp klonlanmadığı tam olarak anlaşılabilir. Ayrıca, klon DNA'nın teyit edilmesi sonrası geniş ölçekli üretim için koloniler sıvı besiyerine transfer edilerek daha hızlı çoğaltılır ve çok sayıda klon DNA molekülünü içeren bakteri popülasyonu oluşturulur. Bu kültürler düşük sıcaklıklarda uzun süre saklanabilir.

Restriksiyon Enzimi Haritalaması:

Teyit yöntemlerinden birisi jel elektroforezini de içeren restriksiyon enzimi haritalamasıdır. Bu deneyi belirli kontrol grupları ile kıyaslayarak gerçekleştirmek önemlidir.

PCR:

Bir başka teyit yöntemi ise PCR'dır. İnsert'in klonlandığını gösterebilmek için bu bölgeleri amplifiye edebilecek spesifik primerler tasarlanmalıdır. Bununla beraber, PCR yöntemi göreceli olarak düşük boyuttaki ürünler için hassas olduğundan 3kb'dan uzun DNA parçalarının tespiti için bu yöntem önerilmektedir.

Radyoaktif Etiketli Problarla DNA Hibridizasyonu:

Bu yöntem, klon DNA'ya sahip kolonilerin görüntülenmesi için kullanılmaktadır. İlk olarak insert DNA'yı içeren rDNA ile hibridize olabilecek radyoaktif işaretli problar tasarlanır. Probların klonlarla hibridize olabilmesi için petri kabındaki hücreler parçalandıktan sonra rDNA'lar denatüre edilir ve prob DNA'lar denatüre olmuş rDNA zincirlerine bağlanır. X-Ray görüntüleme yöntemleri etkili probların ışımasını sağlarken, ışımanın gerçekleşmesi klon DNA'nın varlığının kanıtıdır.

DNA Dizileme/Sekanslama:

Klonlamanın başarılı olup olmadığını gösteren en güvenilir ve en önemli yöntem sekanslama yöntemidir. Sekanslama sayesinde klonlanmış insert'in varlığı dizi analizi yapılarak anlaşılır. Elde edilen verilerdeki sekans insert DNA ile aynıysa klonlama başarılı sayılır.