Agaroz Jelden DNA Ekstraksiyonu Protokolü

Agaroz jelden DNA ekstraksiyonu metodu, jel elektroforezi sonrası belirlenen bir büyüklükteki DNA fragmanını jelden çıkarmak ve saf bir halde izole etmek için kullanılır. Agaroz jelden DNA ekstraksiyonu sonrası elde edilen DNA, iyi bir saflığa ve konsantrasyona sahipse down-stream uygulamalarda (PCR, restriksiyon enzimi kesimi, sekanslama, klonlama gibi) kullanılabilir halde olacaktır.

Binding Buffer (Bağlama Tamponu):

Kaotropik ajanlardan oluşan bir tampon olup agaroz jelin eritilmesine ve eriyen jelden DNA'nın column üzerindeki silica matrikse (membrana) bağlanması pH ile yakından ilişkilidir (özellikle pH<7). Eğer ortamın pH'ı yüksek ise DNA'nın silica membrana bağlanma şansı çok azalır. Bu yüzden, bağlama tamponu aynı zamanda bir pH indikatörü olarak çalışacak şekilde dizayn edilmiştir. pH indikatörü özelliği, solüsyonun renk değiştirip değiştirmediğini anlamamıza yardımcı olur. Örneğin; istenen düzeydeki pH aralığı (DNA'nın silcaya bağlanması için gereken pH) tamponun sarı renkli olmasını sağlarken, daha yüksek pH'larda tampon rengi mavi-mor renk alıyorsa ortamın pH'ı değişmiş demektir. pH tekrar ölçülerek, optimal düzeye asit ilavesiyle ulaşılmalıdır.

Normal şartlarda DNA, RNA, protein gibi moleküller su içerisinde oldukça iyi çözünür ve hidrofoliktir. Suda çözünme sırasında, bu moleküllerin çevresinde sudan oluşan ve moleküllerin suda çözünür halde kalmasını sağlayan hydrate shell (su kabuğu) oluşur. Ortama kaotropik ajanlar eklendiği zaman bu ajanlar, suda çözünen moleküllerin çevresindeki su kabuğunu parçalar ve molekülleri hidrofobik hale getirir. Ayrıca kaotropik ajanlar, içerdiği + yüklü iyonlar (katyonlar) ile silica membranı pozitif yüklü hale getirir ve negatif yüklü DNA'nın hidrofobik ortamda silica membrana daha sıkı biçimde bağlanmasını sağlar. Ayrıca, ortamda protein kontaminasyonu varsa, kaotropik ajanlar protenilerdeki hidrojen bağlarını parçalayarak proteinlerin çökmesine neden olur.

DNA izolasyonunda silica temelli spin-column'a ilave edilen kaotropik ajanlar, silica membranın üzerine DNA'nın bağlanmasını sağlarken, protein gibi molekülleri denatüre ederek DNA çevresinden uzaklaştırır. Bir diğer etkisi ise DNaz ve RNaz gibi nükleik asitleri parçalayan enzimler üzerinedir. Kaotropik ajanlar protein yapılı bu enzimleri inhibe ederek nükleik asitlerin sindirilmesinin (parçalanmasının) önüne geçer. Kaotropik tuzlara örnekler: fenoller, etanol, guanidin hidroklorid, üre...

Wash Buffer ve Elution Buffer (Yıkama Tamponu ve Elüsyon Tamponu):

Yüksek konsantrasyondaki kaotropik ajanlar, DNA'nın saflığını olumsuz yönde etkileyebilir ve down-stream uygulamaların verimini azaltabilir. Bu yüzden, belirli bir aşamadan sonra DNA'dan uzaklaştırılmaları gerekir. Yıkama tamponu, genellikle alkol içerikli (etanol) tamponlar olup DNA'nın yıkanması için kullanılır. Kaotropik ajanlar ve protein gibi diğer muhtemel safsızlık etkenleri, yıkama tamponu ve santrifüj yardımıyla DNA çevresinden uzaklaştırılır.

Elüsyon tamponu ise DNA'yı tekrar hidrofilik forma sokmak ve çözünebilir bir tampon içerisinde saklamak amacıyla kullanılır. Hidrofilik hale geçen DNA, silica membrandan ayrışarak spin-column'dan ependorf tüp içerisine geçer. Elüsyon tamponları genellikle TE (Tris-EDTA) tamponu olarak da bilinir. Elüsyon tamponu, içerdiği Tris sayesinde bazik özellik sergilediği için, DNA'nın pH'ın 7'nin altında iken (asidik) bağlandığı silica membranından ayrışmasını kolaylaştırır. EDTA ise DNA örneğinin uzun süre saklanması için önemli role sahiptir. EDTA, Mg+2 gibi metalleri şelatlayarak (kendine bağlayarak) ortamdan uzaklaştırdığı için, Mg+2'ye bağlı çalışan DNA parçalayıcı enzimlerin (DNaz'ların) de aktivitesini engeller ve Tris ile birlikte uzun süreli DNA saklama kapasitesi gösterir.

EZ-10 Spin Colum DNA Jel Ekstraksiyon Kit Protokolü

Kit İçeriği:

• Binding Buffer II

• Washing solution

• Elution Buffer

• EZ-10 Column

Kit Özelliği:

Bu kit, silica tabanlı spin-column pürifikasyonunda kullanılır ve 10 ug'a kadar DNA'nın izolasyonunu sağlayabilir. Nükleotidler, oligonükleotidler (40 baz çiftinden küçük), enzimler, mineraller, yağlar ve diğer safsızlık etkenleri (kontaminantlar) yıkanarak DNA'dan uzaklaştırılır. DNA izole edildikten sonra down-stream uygulamalarda kullanılmaya hazırdır.

Agaroz Jel İçin Protokol:

• İstenilen DNA fragmanını UV transillüminatör altında belirleyin ve keskin bir bistüri ile fragmanın olduğu jel parçasını keserek çıkarın. Ardından kesilen jeli, 1.5 ml'lik santifüüj tüpüne aktarın ve ağırlığını ölçün.

• Her 100 mg'lık örnek için tüpün içerisine 400 uL Binding Buffer II ekleyin (yani tartılan ağırlığın 4 katı hacimde tampon ekleyin). Sonra, tüpü 50-60 derecede 10 dakika kadar inkübe edin ve ara sıra agaroz tamamen çözünene kadar tüpü hafifçe sallayın. Eğer jel çok daha yüksek konsantrasyonda agaroz içeriyorsa (%1.5-2) 7 katı Binding Buffer II ekleyin.

Not:

Binding Buffer'ı ekledikten sonra tüpün içerisindeki karışımın rengini kontrol ediniz. Eğer karışımın rengi sarı ise tüm olaylar optimum pH aralığında sürdürülmektedir. Eğer karışım mavi ya da mor renge dönüyorsa küçük hacimlerde sodyum asetat kullanarak pH'ı dengelemeli ve ekstraksiyon işlemine devam etmelisiniz.

• İnkübasyon bittikten sonra, tüpteki agarozun tamamen çözündüğünden emin olun ve tüpün içindeki karışımı EZ-10 spin-column içerisine transfer ederek 2 dakika oda sıcaklığında bekleyin. 2 dakika bitince tüpü 10.000 rpm'de 2 dakika santrifüj edin. Santrifüj sonunda toplama tüpüne geçen sıvıyı uzaklaştırın.

• Spin-column içerisine 750 uL Wash Solution ekleyin ve 10.000 rpm'de 1 dakika santrifüj yaparak toplama tüpüne geçen sıvıyı tekrar uzaklaştırın.

• 4. adımı tekrarlayın. Tekrarladıktan sonra spin-column'u ekstra olarak 1 dakika 10.000 rpm'de Wash Solution olmaksızın santrifüj edin.

• Spin-column'u toplama kolonundan çıkarın ve 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne yerleştirin. İçerisine 30-50 uL kadar Elution Buffer ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe ettikten sonra 10.000 rpm'de 2 dakika santrifüj yaparak DNA'yı elüye edin.

Not:

Elüsyon işlemi yaparken, Elution Buffer'ın spin-column'un tam merkezine ulaşmasına dikkat edin. Aksi takdirde yüksek miktarda DNA elde edemeyeceksiniz. Ayrıca, Elution Buffer'ı kullanmadan önce 55-80 dereceye ısıtmak DNA ekstraksiyonun başarısını arttıracaktır.

• Santrifüj sonrasında ependorfa çöken sıvıda DNA yer alacaktır. DNA -20 derecede saklanabilir. Uzun süreli saklama için -80 dereceye alın.

Kaynak:

• Norgen Biotek. DNA Gel Extraction Kit İnsert. Bağlantı

• Bitesize Bio. How DNA gel extraction works. Bağlantı

• Researchgate. What hapens to DNA in the presence of a chaotropic salt. Bağlantı

• Wikipedia. Spin column based nucleic acid purification. Bağlantı

• Addgene Blog. Ways to elute and store plasmid dna. Bağlantı

• Genetic Education. İmportance of tris edta te buffer in dna extraction. Bağlantı