DNA İzolasyon Yöntemleri

DNA izolasyonu Nedir?

Çeşitli örneklerden, kimyasal ve fiziksel metotlar kullanılarak, DNA'nın diğer moleküllerden ayrışmış (saf) bir biçimde elde edilmesi işlemine DNA izolasyonu adı verilir.

DNA izolasyonunda amaç:

Saf haldeki DNA'ya ulaşmak ve diğer hücresel tüm molekülleri DNA'dan uzaklaştırmaktır.

DNA İzolasyonunun Uygulama/Kullanım Alanları

Bilimsel çalışmalarda DNA:

• Genler ve genlerle ilişkili dizilerin belirlenmesi,

• Polimorfizmlerin belirlenmesi,

• Eigenetik,

• Klonlama,

• CRISPR,

• Aşı çalışmaları,

• Genetiği değiştirilmiş organizmaların üretilmesi...

Tıp alanında DNA:

• Genetik hastalıkların teşhisi ve mekanizmalarının anlaşılması,

• Genetik hastalığı taşıyan genlerin belirlenmesi,

• Gen terapisi çalışmaları,

• Farmakogenomik çalışmalar,

• Rekombinant DNA teknolojisi ile aşı, hormon üretimi,

• Bireylerin çeşitli hastalıklara yatkınlığının incelenmesi, erken teşhis...

Adli bilimlerde:

• Suçluların tespit edilmesi,

• Analık-babalık testi...

DNA down-stream uygulamaları:

• DNA sekanslama,

• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR),

• Kantitatif PCR (qPCR),

• Southern blotting,

• Random amplification of polymorphic DNA (RAPD),

• Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP),

• Single nucleotide polymorphism (SNP)...

DNA İzolasyonunun Genel Adımları

1. Hücrelern parçalanması (lizis)

2. Membran lipidlerinin, proteinlerin, RNA ve diğer moleküllerin DNA'dan uzaklaştırılması (seperasyon, ayrıştırma)

3. DNA'nın pürifiye edilmesi (pürifikasyon, saflaştırma)

4. DNA'nın saflık ve konsantrasyon değerlerinin belirlenmesi

İdeal Bir DNA İzolasyonu Nasıl Olmalıdır?

1. Maksimum miktarda DNA'nın izole edildiği,

2. Kontaminantların uzaklaştırıldığı,

3. Nükleazların inhibe edildiği ya da uzaklaştırıldığı,

4. Amaca göre çift ya da tek zincirli DNA'nın izole edildiği prosedürleri içerir.

DNA izolasyonu yöntemi seçerken dikkat edilmesi gereken yerler

• DNA izolasyon yöntemleri,

  • DNA'nın elde edileceği kaynağın cinsine,

  • Örnek miktarına,

  • Laboratuvar olanaklarına,

  • Zaman veya maliyet

DNA İzolasyonu Yöntemleri

• Organik DNA ekstraksiyonu (Fenol-Kloroform)

• Non-organik DNA ekstraksiyonu (Proteinaz K, Salting out ve silica tabanlı çalışmlalar)

• Kromatografik ekstraksiyon

• Filtre kağıdı ile yapılan ekstraksiyon

Organik DNA ekstraksiyonu: Fenol-kloroform (hücre lizis edildikten sonra)

• Fenol, DNA izolasyonunda proteinleri denatüre ederek çöktürür ve DNA/RNA moleküllerinden ayrıştırır.

• Kloroform, DNA/RNA fazının yoğunluğunu arttırır ve fenol içeren fazın DNA/RNA fazının içerisine sızmasını engeller.

Organik DNA ekstraksiyonu: Fenol-kloroform, DNA presipitasyonu/ayrıştırması

• Yüksek tuz konsantrasyonu ile (salting out) : Yüksek tuz konsantrasyonu, proteinlerin çöktürülmesinde de tercih edilir. Süpernatant alınarak izolasyon sürecine devam edilir.

• Alkol ile çöktürme: DNA'nın çöktürülmesinde ise etanol kullanılır. Etanol santrifüj sonrası tüpte üst fazda yer alırken, DNA'yı pelet halinde tüpün dibinde bırakır.

Organik DNA ekstraksiyonu: Fenol-kloroform, DNA'nın yıkanması

• DNA presipitasyonu ile birlikte pelet içerisinde tuzlar da yer alabilir.

• Yüksek tuz konsantrasyonu DNA'nın çözünürlüğünü azaltacağından DNA'dan uzaklaştırılmalıdır.

• Bunun için, DNA peleti %70'lik etanol ile yıkanır (elüsyon).

DNA'nın resüspanse edilmesi, saflığının ve konsantrasyonunun belirlenmesi

• Yıkama işleminden sonra, DNA molekülü pelet halinde bırakılmamalı ve bir çözücü içerisinde (gerekirse RNaz içeren) homojen biçimde çözdürülmelidir.

• Çözdürme işlemi, DNA'nın uzun süreli saklanması için genellikle TE (Tris-EDTA) tamponu ile gerçekleştirilir.

• Bu tamponda dikkat edilecek nokta, EDTA'nın düşük konsantrasyonda tutulması gerekliliğidir. Yüksek EDTA konsantrasyonu Mg iyonlarını şelatlayacağından PCR'ı inhibe edebilir.

• DNA'nın saklanmasında ayrıca, DNaz-free (DNaz içermeyen) su da kullanılabilir. (-20 derece)

• DNA'nın saflığı ve konsantrasyonu ise spektrofotometre ile belirlenebilir.

Silica tabanlı spin-column ile DNA izolasyonu

• Hücre lizisinden sonra DNA'nın hızlı bir biçimde izole edilmesinde kullanılır.

• Hücre lizatı içerisindeki DNA, kaotropik tuzlar varlığında silica membranı adı verilen bir katı faza bağlanır.

• Diğer istenmeyen moleküller ise santrifüj ve yıkama ile alttaki tüpe geçerek ortamdan uzaklaştırılır.

• Silica'ya bağlı DNA ise su veya elüsyon tamponu ile silicadan ayrıştırılır.