PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve Bileşenleri

Geleneksel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Nedir?

PCR, tek ya da birkaç kopyadan oluşan nükleik asit örneği üzerindeki herhangi bir bölgenin/dizinin özgül bir biçimde milyonlarca ve hatta milyarlarca sayıda kopyalanabilmesine olanak tanıyan bir moleküler biyoloji tekniğidir. PCR'da çoğaltılan nükleik asit DNA ya da RNA olabilir.

PCR Bileşenleri Nelerdir?

• Kalıp DNA

• DNA polimeraz

• Primerler

• dNTP'ler

• Magnezyum iyonları

• PCR tamponu

Kalıp DNA

Kalıp DNA, çoğaltılması istenen DNA dizisini/bölgesini içeren büyük DNA molekülüdür. Kalıp DNA, genomik DNA, cDNA veya bir plasmid olabilir. PCR'da kalıp DNA uygun miktarlarda reaksiyon ortamlarına dahil edilmelidir. Örneğin, genomik DNA reaksiyon ortamına 5-50 ng kadar eklenir. Bu miktardan daha az kullanılan örnekler PCR'ın doğru çalışmasını engelleyebilir. Daha fazla miktarda DNA kullanımı ise primerlerin farklı DNA bölgelerine bağlanma ihtimalini arttırabilir ve jel elektroforezinde non-spesifik bantlar görmemize neden olabilir.

DNA Polimeraz

PCR deneyinde kalıp DNA'nın çoğaltılmasını sağlayan enzimdir. İlk defa 1976 yılında Thermus aquaticus adı verilen ekstrem sıcaklıklara dayanıklı bir bakteri türünden izole edilmiş (Taq DNA polimeraz) ve yüksek sıcaklıklarda bile güçlü biçimde çalıştığından PCR'ın icat edilmesine büyük katkısı olmuştur. Bu enzim 95 derecede 40 dakika boyunca yüksek verimlilikte çalışmaktadır. Günümüzde ise daha yüksek verimle çalışan enzimler de kullanılmaktadır. (örnek; Pfu polimeraz)

Primerler

Primerler, sentetik ve tek zincirden oluşan 18-30 bazlık DNA molekülleridir. Görevi, kalıp DNA'nın zincirlerine bağlanmak ve PCR'da çoğaltılması istenen bölgeyi DNA polimeraza rehberlik ederek çoğaltmaktır. Bu yüzden, çoğaltılacak bölgeye uygun özgül primerler tasarlanmalıdır.

Deoksinükleozid Trifosfatlar (dNTP'ler)

dNTP'ler dört farklı nükleotid karışımından oluşur: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Görevleri, polimerazın yeni zinciri sentezleme aşamasında kalıp DNA'ya komplomenter dizilerin oluşturulması için serbest nükleotidler olarak ortamda hazır bulunmasıdır.

Magnezyum İyonları

PCR reaksiyonuna ilave edilen magnezyum iyonlarının iki önemli işlevi vardır: DNA polimeraziçin bir kofaktör olarak görev yaparak dNTP'lerin primerlerin ucuna ileve edilmesini sağlar. Primer ve kalıp DNA arasındaki bağlantıyı güçlendirir.

PCR Tamponu

PCR tamponu, PCR reaksiyonu boyunca DNA polimerazın en iyi şekilde çalışabileceği uygun pH aralığına sahip bir ortamı sağlar. Örneğin; bu tampon içinde bulunan Tris-HCl, reaksiyon ortamını pH 8-9.5 aralığında tutar. Tampon içerisinde ayrıca PCR enhansırları olarak da adlandırılan çeşitli moleküller de bulunur. Örneğin, tampona KCl veya amonyum sülfat ilavesi, primerlerin kalıp DNA'ya bağlanma özgüllüğünü arttırır ve primerlerin istenmeyen DNA bölgelerine bağlanma ihtimalini azaltır.

PCR'ın Döngüleri

PCR, temel olarak thermal cycling olarak da adlandırılan üç genel aşamadan (20-40 döngü toplam) oluşur:

1. DNA denatürasyonu

2. Primer bağlanması

3. Primer uzaması

Not: Bu üç aşama tamamlandığında 1 PCR döngüsü gerçekleşmiş olur.

Bu üç aşamadan oluşan 20-40 döngüye ilaveten, her PCR'da bu döngüler başlamadan önce Başlangıç Denatürasyonu ve son döngü tamamlandıktan sonra da Final Uzaması gerçekleştirilir.

1. Başlangıç denatürasyonu (1 döngü)

2. DNA denatürasyonu

3. Primer bağlanması

4. Primer uzaması

5. Final uzaması (1 döngü)

Başlangıç Denatürasyonu (94-98 Derece, 1-3 dk)

Özellikle hot-start PCR adı verilen PCR yönteminde önem arz eden bir aşamadır. Geleneksel PCR'da oda sıcaklığında reaksiyon karışımını hazırlarken dahi primerlerin hedef bölge yerine farklı DNA bölgelerine bağlanma ihtimali vardır. Özel tasarlanan polimeraz enzimleri (hot-start polimerazlar) yalnızca başlangıç denatürasyonu aşamasında aktif olur ve böylece deneyin hazırlanma aşamasında farklı bölgelerin çoğaltılmasına engel olunur. Başlangıç denatürasyonu ayrıca, DNA denatürasyonu aşamasına bir hazırlık olarak DNA'nın iki ayrı zincir halinde hazır bulunmasını sağlar ve PCR verimini arttırır.

DNA Denatürasyonu (94-98 derece, 20-30 sn)

DNA denatürasyonu, ortamdaki DNa zincirleri arasındaki hidrojen bağlarının yüksek sıcaklıkta erimesi ve iki zincirin bağımsız hale geçmesi aşamasıdır. Böylelikle, zincirler arasında primerlerin bağlanması için gerekli boşluğa erişilir.

Primer Bağlanması (48-72 derece, 20-50 sn)

DNA denatürasyonu sonrasında ayrılan zincirlere F ve R primerlerinin bağlanabilmesi için gerekli sıcaklığı sağlayan PCR aşamasıdır. Primer bağlanma sıcaklığı (Ta) primer Tm değerleri üzerinden hesaplanır. Primerlerin sahip olduğu Tm değerlerinin 3-5 derece altında olması gerekir. Tm ve Ta arasındaki fark 3-5 dereceden daha az olur ya da Ta Tm'den daha fazla olursa primerlerin kalıp DNA'ya bağlanma şansı azalır. Tm ve Ta arasındaki fark 3-5 dereceden daha fazla olursa primerlerin farklı DNA bölgelerine bağlanma ihtimali artar.

Primer Uzaması (68-72 derece, 20-50 sn)

Primer bağlanması aşamasından sonra primerlerin 3' ucundaki OH grubundan itibaren DNA polimeraz, ortamda serbest halde bulunan dNTP'leri yeni üretilen DNA zincirini oluşturmada kullanır. Primerlerden itibaren kalıp DNA'ya komplementer olarak üretilen yeni DNA zinciri polimeraz ile uzatılmaya başlar. (5' yönünden 3' yönüne)

Final Uzaması (68-72 derece, 5-15 dk)

Final uzaması amplifikasyon döngüsü tamamlandıktan ancak, PCR sonlandırılmadan önce uygulanan son döngüdür. Bu föngünün amacı, ortamda tek zincirli DNA bırakmadan tüm DNA'ların polimerazlar aracılığıyla çift zincirli hale getirildiklerinden emin olmaktır.

Agaroz Jel Elektroforezi

Geleneksel PCR sonrası oluşan ürünlerin boyutunu ve spesifitesini araştırmak için elde edilen ürünler agaroz jel elektroforezinde yürütülür ve araştırılır.

Kaynak:

• Promega. PCR amplification. Bağlantı Promega

• Termofisher. PCR Cycling Parameters—Six Key Considerations for Success. Bağlantı Termofisher