Gen Klonlama Aşamaları Nelerdir ve Biyotransformasyon Aşamaları

Klonlama Nedir?

Ortak bir atadan köken alan genetik olarak tamamen aynı organizmalar ya da moleküler klon olarak adlandırılır.

Modern biyolojide klonlama

• Tıpkı Dolly isimli koyunun aseksüel olarak klonlanması gibi bir organizmaya klonlama ya da

• Tek bir kopya DNA molekülünden milyonlarca DNA molekülünün bakteri hücresi içerisinde klonlanması şeklinde terimlendirilir.

Klonlama; bir havuç dokusundan toplanan tek bir hücre ile kök ve gövde oluşumu sağlanabilir. Bu durumda hücrelerin izole edildiği havuçla tıpatıp aynı genotipte (klon) havuçlar üretilir. Başka bir örnekle açıklanacak olursa, klonlanan ilk hayvan olan Dolly için nükleer transfer yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntemde donör bir koyundan toplanan vücut hücresinin önce nükleusu çıkarılmıştır. Çıkarılan bu nükleus, dişi bir koyuna ait bir başka nükleusu çıkarılmış yumurta hücresine transfer edilmiştir. Yumurta hücresinde embriyonik gelişim laboratuvar ortamında başlatıldıktan sonra çoğalan hücreler taşıyıcı bir anneye aktarılmıştır. Taşıyıcı anneden dünyaya gelen yavru ise vücut hücresinden nükleusu izole edilen donör koyunun klonudur.

DNA/Gen Klonlama

DNA klonlaması ise bir DNA molekülünün çok sayıda kopyasının elde edildiği bir moleküler biyoloji tekniğidir. Bu teknik sayesinde,

• bir genin yapısı ve organizasyonu incelenebilir,

• bir gene spesifik üretilen transkriptlerin ve proteinlerin sentezlenmesi ve araştırılması sağlanır,

• bir genin klon olarak tabir edilen çok sayıda kopyası elde edilir.

DNA klonlaması yöntemi rekombinant DNA teknolojisine dayanır. Rekombinant DNA teknolojisi, laboratuvar ortamında iki ya da daha fazla DNA molekülünün birleştirilip tek bir DNA molekülü (rekombinant DNA; rDNA) haline getirildiği metotları kapsamaktadır. rDNA'lar mayoz bölünme sırasında gerçekleşen krossing-over (parça değişimi) sırasında oluşabilmektedir. Bununla beraber, oluşan yeni DNA'lar tek bir canlı türüne ait DNA'ların birleşimiyle oluşur. Rekombinant DNA teknolojisinde ise doğal olarak oluşması mümkün olmayan rDNA'ların üretilmesi ve çoğaltılması sağlanır.

Klonlanacak DNA + Taşıyıcı DNA molekülü (vektör) = Rekombinant DNA molekülü (rDNA)

DNA/Gen Klonlaması Neden Yapılır?

• Genom ve gen ekspresyon çalışmaları

• Gen terapisi

• Trasngenik organizma üretimi

• Aşı, hormon, antikor ya da protein üretimi gibi çalışmalarda kullanılır.

DNA/Gen Klonlama Genel Basamakları

1. DNA izolasyonu

2. Kesme işlemi

3. Birleştirme (ligasyon) işlemi

4. Transformasyon

5. Klonlama

6. Seçme (görüntüleme)

1. DNA İzolasyonu:

Klonlanması istenen DNA dizisi, dokulara özgün standart bir total DNA izolasyon yöntemi kullanılarak saf bir biçimde elde edilir. Bu yöntemler, rDNA bileşenleri olan klonlanması istenen DNA dizisini (insert DNA, hedef DNA/gen) ve bu diziyi alıcı bir hücreye aktaracak taşıyıcı bir DNA (vektör) dizisinin izolasyonunu içermektedir.

2. Kesme İşlemi:

İzole edilen DNA yığını içerisinde klonlanmasını istemediğimiz diziler de bulunur. İstenmeyen dizileri elemine etmek ve klonlanacak dizileri spesifik biçimde elde edebilmek için restriksiyon enzimleri adı verilen özel DNA kesim enzimleri kullanılır. Restriksiyon enzimleri, DNA molekülü üzerinde yer alan tanıma dizilerine bağlanarak bu bölgelerden hedef DNA'yı keser ve çıkarır. Restriksiyon enzimleri büyük DNA molekülü içerisinde klonlanmasını istediğimiz bölgeyi spesifik şekilde kesmelidir. Kesilen bu DNA parçası insert DNA olarak adlandırılır. Halkasal yapıdaki vektör de tıpkı insert DNA gibi aynı restriksiyon enzimleriyle kesilerek insert DNA'nın entegre olacağı bir boşluk oluşturulur.

3. Birleştirme (Ligasyon) İşlemi:

Birleştirme işlemi (ligasyon) klonlanması istenen DNA molekülü ve vektörün birbirine yapıştırılması/entegre edilmesi işlemidir. Bu aşamada DNA zincirlerini birbirine bağlayan DNA ligaz enzimleri kullanılır. DNA ligaz enzimleri iki DNA molekülünü birbirine bağladıklarında oluşan yeni ürüne rekombinant ya da kimerik DNA denir.

4. Transformasyon:

Rekombinant DNA'nın klonlanması için uygun bir hücreye transfer edilmesi ve bu hücre içerisinde replikasyona uğratılması şarttır. rDNA molekülünün hedef bir hücreye (kompoetent/alıcı hücre) aktarılması işlemine genetik transformasyon ya da transformasyon adı verilir. Transformasyon bakterilerde doğal şartlarda var olan bir proses olsa da laboratuvar ortamında bilim insanları hızlı ve güçlü rDNA transferi için farklı fiziksel ve kimyasal metotlar geliştirmiştir. Bununla birlikte, biyolojik bir yöntem olarak; virüsler de rDNA molekülünü bakteriye transfer edebilmektedir. Virüs içerisine paketlenmiş rDNA molekülünün bakteriye aktarılması işlemine ise transfeksiyon adı verilir.

5. Klonlama:

Klonlama işlemi bakteri içerisine aktarılan rDNA'nın çok sayıda kopya oluşturacak şekilde olması anlamına gelir. Tıpkı bir DNA replikasyonu gibi bakteri hücresi bu molekülleri sürekli olarak kendi replikasyon sistemleriyle çoğaltmaktadır. Hatta, rDNA içerisinde yer alan insert DNA amaç doğrultusunda ekspresyona uğratılarak mRNA molekülleri elde edilebilir. Bu mRNA moleküllerinin ise proteine transle edilebilmesi mümkündür. Replikasyon için en önemli husus insert DNA'nın, vektör DNA'nın ve kompotent hücrenin birbirleri arasındaki uyumudur. Bu üç faktörün uyumu iyi bir şekilde optimize edildiğinde çok sayıda klon rDNA molekülünün üretimi kolaylaşacaktır.

6. Seçme (Görüntüleme):

İnsert DNA'nın yerleştirildiği vektörler genetik marker genleri olarak adlandırılan özel diziler içermektedir. Bakteriler kültür şartlarında koloni biçiminde çoğaldıklarından genetik marker genleri klonladığımız DNA'yı içeren bakterilerin olduğu kolonileri tanımamıza yardımcı olmaktadır. Çünkü transformasyon işlemi her zaman kusursuz ilerlemediği için rDNA'yı kesmeli, içeren hücreleri tespit etmek klonlanmış DNA'ların hangi kolonide olduğu anlaşılması için oldukça önemlidir. Klonlanan DNA'yı içeren koloniler belirlendikten sonra kantitatif analizler ile klon DNA'nın varlığı teyit edilmelidir. Bu amaçla kolonilerden izole edilen klon DNA'ların saptanması için:

• Jel Elektroforezi Deneyleri,

• Dizi Sekanslanması,

• PCR Reaksiyonları ya da

• Blotlama teknikleri gerçekleştirilir.