PCR için Primer Dizaynı

PCR Primerleri

Hücrelerde gerçekleşen DNA sentezi, primer olarak adlandırılan kısa ve tek zincirli nükleik asitlerin DNA'ya bağlanmasıyla başlarken, bağlanmanın gerçekleştiği bölgeden polimeraz enzimleriyle kalıp DNA'ya komplementer yeni bir DNA zinciri sentezlenir. Sentetik primerler ise oligonükleotid yapılı sentez edilen moleküller olup, laboratuvar ortamında üzerinde çalışılan kalıp DNA'nın çoğaltılması amacıyla kullanılır.

Hücrelerden gerçekleştirilen izolasyon protokolü sonunda elde edilen DNA molekülü çok büyük olduğundan spesifik bölgelerin/dizilerin çalışması oldukça zor olacaktır. DNA bölgelerine spesifik sentetik primerler tasarlandığında PCR ile birlikte çalışması istenen bölgeler çoğaltılarak araştırmacının o bölgeye ait milyonlarca DNA kopyasına sahip olması sağlanır. Spesifik dizilere/bölgelere bağlanacak şekilde dizayn edilen spesifik primerler deney ortamında kalıp DNA'ya baz içeriğinden dolayı spontane şekilde rahatlıkla bağlanabilmektedir. Primerlerin kalıp DNA'ya bağlanmasının ardından PCR'ın uzama/amplifikasyon (extension) evresinde polimerazlar aracılığıyla ilgili bölgede çoğaltılmaya başlanır ve dizayn edilen primerler sayesinde 2 üzeri döngü sayısı kadar kopya PCR ürünü elde edilmiş olur.

Dejenere Primerler Nedir?

Dejenere primerler farklı baz içeriğine sahip oligonükleotidlerin bulunduğu bir primer karışımını oluşturur. Özellikle çalışılan organizmaya ait DNA'da yer alan bir bölgenin dizisi bilinmiyorsa; bu organizmaya yakın türlerde dizisi bilinen benzer bölgenin sekanslarını çoğaltacak alternatif primerler dizayn edilerek çalışılan organizmadaki ilgili DNA sekanslarının polimerizasyonu amaçlanır. Ayrıca, dejenere primerler yardımıyla amino asit sekansı bilinen ancak kodlandığı gene ait DNA dizisi bilinmeyen genlerin de çoğaltılması sağlanabilmektedir.

Örneğin; bir gene ait protein ürününün amino asit sekansı biliniyor, ancak, bu genin DNA sekansı bilinmiyorsa dejenere primerler oluşturularak bu bölge çoğaltılabilmektedir. Çeşitli amino asitlerin yapımını sağlaan kodonlara ait diziler her bir dejenere primere alternatif biçimde eklenerek ilgili DNA bölgesinin çoğaltılma seansı arttırılmış olur.

Özgün Primerler Nedir?

Özgün primerler ise yalnızca spesifik bir bölgeye göre dizayn edilmiş primerlerdir. Farklı herhangi bir DNA sekansına bağlanmazlar. Bu primerlerin tasarımı için oldukça hassas bir planlama gerekmektedir. Çünkü özgün primerleri oluşturamamak hedef DNA sekanslarının dışında farklı bölgelerin de çoğaltılması anlamına gelecektir. Özgün primerleri tasarlarken biyoinformatik bilimine başvurulur. Primerlere ait özgünlük BLAST adı verilen biyoinformatik araçlar ile gerçekleştirilir.

PCR Primerleri Tasarlarken Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar

GC İçeriği:

GC içeriği; yani guanin ve sitozin oranı, primerin sahip olduğu tüm bazların %40-60'ını içermelidir. Bu orandan düşük ya da fazla GC içeriği bir primerde ideal değildir. Ayrıca primerin 3' ucuna G ya da C eklemek DNA kalıbına oligonükleotidin bağlanma özelliğini ve polimeraz aktivitesini arttıracaktır. Çünkü G ve C, adenin ve timine göre daha kararlı bir bağlanma gerçekleştirmektedir.

Primerin Uzunluğu:

İdeal bir primer genellikle 18-30 baz arası uzunlukta olmalıdır. Bir primerin özgünlüğünü belirleyen en önemli unsurlardan bir tanesi uzunluğudur. Çünkü primer ne kadar kısa olursa bağlanması o kadar kolaylaşacaktır. Bununla birlikte, 18 bazın altındaki primlerlerin farklı bir bölgeye bağlanma ihtimali artar.

Erime Sıcaklığı (Tm; Melting temerature):

Erime sıcaklığı, DNA çift zincirinin yarısının tek zincirli forma denatüre olduğu, yarısının ise halen çift zincir yapıda kaldığı sıcaklıktır. Bu sıcaklıkta deney ortamında primer bağlanmış ve primer bağlanmamış DNA zincirleri bir denge halinde bulunur. Tm hassas bir biçimde hesaplandığında ve deneye entegre edildiğinde PCR döngüsü ilerledikçe oluşan DNA moleküllerine primerler kusursuz bir biçimde bağlanır ve DNA sentezi uygun şekilde yürütülür. Bu yüzden Tm değeri oldukça önemlidir. 65 ve üzeri sıcaklıklar PCR verimini azaltır.

İkincil Yapılar:

İkincil (sekonder) yapılar primerlerin kendi üzerine katlandığı/bağlandığı durumlarda ortaya çıkan ve PCR verimini direkt olarak etkileyen bir durumdur. Primerleri tasarlarken özellikle ikincil yapılar oluşturması muhtemel G, C ve A, T bazlarının bir denge içerisinde primere entegre edilmesi gerekir. Primerlerin 5' ve 3' ucundaki komplementer sekanslar primerin kendi kendine bağlanmasına ve sekonder yapıların oluşmasına sebep olabilmektedir. Aynı zamanda F ve R primerlerindeki homolojiler de primerlerin birbirlerine bağlanmasına neden olabilmektedir.

Baz Tekrarları:

4 ya da daha fazla tekrar eden baz veya baz çiftinin primer içerisinde yer almaması gerekir. Bu durum primerin hedef DNA bölgesine bağlanma ihtimalini azaltır.

Primer Çiftleri Arasındaki Uyum:

PCR deneyinde kullanılan primerler (F ve R) eşit konsantrasyonda deney ortamına dahil edilmelidir. Ayrıca bu konsantrasyonlar, kullanılan protokolde önerilen rakamın üzerinde olmamalıdır. Çünkü yüksek primer konsantrasyonu primerlerin birbirine bağlanmasına neden olabilmektedir. Ayrıca her bir primerin bağlanma sıcaklıkları arasında maksimum 3 derecelik bir fark olması gerekir. Bu fark ne kadar az olursa primerler DNA zincirine eşit şekilde bağlanır ve PCR verimli biçimde çalışır.

Restriksiyon Enzimleri için Kesim Bölgesi:

Primerlerin 5' ucuna yaklaşık 5-6 dizi uygun bazlar eklenerek istek doğrultusunda restriksiyon enzimlerinin ilgili dizilerden zinciri kesebilmesi sağlanabilir. Restriksiyon enzimleri DNA zincirini spesifik dizilerden tanıyarak kesebilen enzimdir.