DNA İzolasyonunda Kullanılan Tampon ve Çözeltiler

DNA izolasyonunda kullanılan kimyasalların görevleri

Bir tampon çözeltisi,

• Bir zayıf asit ve onun konjuge (eşlenik) bazını ya da

• bir zayıf baz ve onun konjuge (eşlenik) asidini içeren sıvı çözeltilerdir.

Tampon çözeltiler, bulundukları ortama güçlü bir asit veya baz eklendiğinde bu maddelerin pH değişimine karşı direnç gösterir ve ortamın pH'ının sabit kalmasını sağlar. Vücumuduzda da tampon sistemleri mevcuttur. Buna en iyi örnek; kan pH seviyemizi düzenleyen bikarabonat-karbonik asit tampon sistemidir. Moleküler biyoloji laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan bazı tamponlara TE (tris-EDTA), PBS (fosfat tamponlu tuz çözeltisi), TAE (tris-asetik asit-EDTA) ve TBE (tris-borik asit-EDTA) örnek verilebilir.

İzolasyonda Kullanılan Tamponlar ve Kullanım Amaçları

Tris (pH~8):

DNA izolasyonu sırasında, deneyin gerçekleştiği ortamın pH'ını sabit tutmak için kullanılır. DNA, pH'a oldukça duyarlı bir molekül olduğu için ortamın sürekli olarak bir tampon ile sabit pH aralıklarında bulunması gerekir. Örneğin; düşük pH'larda DNA yapısında bulunan pürin bazları zincirden ayrışır ve DNA yapısı bozulur. Yüksek pH'ta ise (9 ve üzeri) DNA zincirleri arasındaki hidrojen bağları parçalanır ve zincirler denatüre olur. Bu yüzden, DNA izolasyonunun sağlıklı bir biçimde gerçekleştirilmesi adına Tris kullanımı önerilmiştir. Tris, tamponlama vazifesini pH 7 ve 9 arasında gerçekleştiren bir tampondur. Ortama bir asit ya da baz ilave edilse dahi, pH'ı yaklaşık 8 civarında tutarak DNA'nın stabil kalmasını sağlar. Tris'in bir başka özelliği ise hücre lizisi üzerindedir. Membranda bulunan lipopolisakkaritlerle etkileşerek hücre zarının parçalanmasına yardımcı olur.

EDTA (pH~8):

EDTA, bir şelatlayıcı ajan olarak çalışır. Özellikle, serbest haldeki metal iyonlarını şelatlayarak (kendisiyle bir kompleks oluşturarak) izolasyon ortamından uzaklaştırır. Metal iyonları pek çok enzimin kofaktörü olarak çalışır. Bu enzimlerden bazıları DNaz'lardır. DNaz'lar DNA'yı parçalayan enzimer olduğu için izolasyon boyunca bu enzimlerden korunmak gerekir. EDTA hazırlanırken kullanılan suyun pH'ının 8 olması önemlidir. Çünkü, EDTA düşük pH'larda çözünememektedir.

NaCl (tuz) Çözeltisi:

NaCl'nin (sodyum klorür) DNA izolasyonundaki ana görevi DNA'ya bağlı halde bulunan proteinleri uzaklaştırmak ve DNA'nın saflığını arttırmaktır. Aynı zamanda, Naž+ iyonları sayesinde DNA'nın yükü nötralize olduğundan, DNA daha kompakt bir yapıya sahip olur ve etanol yardımıyla çöktürülen DNA'nın tüpün dibinde bir bütün halde ve görünür şekilde kalmasını kolaylaşır. Bu sayede proteinler, DNA'ya tekrar bağlanmaz ve süpernatant kısmında çözünür halde kalırlar.

Soğuk Saf (%100) Etanol:

DNA, saf alkol içerisinde çözünmediği için santrifüj işleminin ardından, alkol içeren ortamdan istenmeyen moleküllerden çökerek ayrışabilir. Etanol, DNA'nın sudaki çözünürlüğünü engeller, yani DNA'yı hidrofobik hale dönüştürür ve santrifüj sonrası DNA'nın NaCl içeren ortamda görünür bir bütün halinde tüpün dibine çökmesini sağlar. Etanol aynı zamanda soğuk kullanılmalıdır. Bunun nedeni, soğuk ortamda DNA çok daha hızlı ve yüksek konsantrasyonda çökmektedir. Soğuk ortamın bir diğer avantajı ise, DNaz gibi enzimlerin düşük sıcaklıklarda çalışamamasıdır.

Saf (%100) İzopropanol:

Saf izopropanol de bazı durumlarda etanol yerine DNA çöktürme işleminde tercih edilebilir. İzopropanol, eğer izole edilecek DNA'nın bulunduğu ortamın hacmi çok büyükse seçilir. Çünkü, DNA'nın bulunduğu büyük hacimdeki bir ortama, mecburen büyük hacimlerde etanol eklenmesi gerekir. İzopropanol küçük hacimlerde eklense dahi DNA'yı güçlü şekilde çöktürür. Hatta, eğer izolasyonun gerçekleştiği kaynaktaki DNA miktarı kısıtlıysa etanol yerine izopropanol tercih etmek izole edilen DNA'nın konsantrasyonunu arttıracaktır. Ayrıca etanolün aksine, izopropanol oda sıcaklığında eklendiğinde daha başarılı sonuçlar verir. Ancak, izopropanol kullanımının bazı dezavantajları da vardır. Örneğin izopropanol, DNA ile birlikte Na+ gibi tuzların da çökebilmesine neden olurken, bu yüzden ortamda tuzlardan kaynaklı kirlilik meydana gelebilir. Diğer dezavantajları ise, etanole kıyasla izopropanol ile çöktürmede DNA peleti saydam şekilde görünürken, alkolün kuruma yoluyla uzaklaştırılması sırasında izopropanolün uçuculuğu pelet üzerinden çok daha yavaş gerçekleşir.

%70'lik Etanol:

%70'lik (70 birim etanol 30 birim su) etanol, DNA'nın yıkanması amacıyla kullanılır. Saf etanol ve tuz ile yapılan çöktürme işlemini takiben, DNA'ya bağlı tuzlar %100'lük etanol varlığında iyi çözünmediği için ortamın saflığını azaltmaktadır. %70'lik etanol, DNA'ya bağlı bu tuzların ortamdan ayrıştırılmasını sağlar. Bunun sebebi alkol içerisinde bulunan %30 oranındaki suyun, tuzları tekrar çözünür hale getirmesidir. Buna karşın saf su kullanılırsa, DNA tekrar çözünür hale geleceği için izolasyon ortamındaki DNA kaybedilecektir. Tuzların %30'luk su bulunan etanol çözeltisiyle uzaklaşmasının yanında, az miktardaki su aynı zamanda DNA'nın hidrofilik özelliğini arttıracaktır. Bu durum, DNA peletinin elüsyonu aşamasında daha kolay ve daha homojen biçimde çözünmesi anlamına gelecektir.

Elüsyon Tamponları:

DNA'yı hem yıkamak hem de tekrar çözünür hale getirmek için kullanılmaktadır. Bu tamponların genel özelliği düşük iyonik güce sahip olmalarıdır. DNaz-RNaz içermeyen su veya TE tamponu DNA'yı kolaylıkla çözebilmektedir. Özellikle silica-bazlı DNA izolasyonunda, elüsyon tamponları DNA'nın silica membrandan ayrışmasını ve çözünmesini kolaylaştırmaktadır. Elüsyon aşamasından sonra DNA izolasyonu işlemi bitmektedir ve DNA'nın saflığının ve konsantrasyonunun belirlenmesi gerekmektedir.

Tris-EDTA Tamponu:

Tris ve EDTA için anlatılan özellikler üzerine, TE tamponu hazırlanarak, DNA, izolasyon işleminden sonra bile uzun süreler TE tamponu içerisinde sağlam şekilde muhafaza edilebilir. TE tamponu hazırlanırken Tris konsantrasyon olarak EDTA'dan 10 kat fazla olmalıdır. Örneğin; TE tamponunda 10 mM Tris varsa, EDTA konsantrasyonu 1 mM olmalıdır. Çünkü yüksek miktarda EDTA kullanmak, DNA ile çalışan PCR, klonlama vs. gibi deneylerdeki enzimlerin aktivitesini etkileyebilir.

Bazı Enzim Çözeltileri

Lizozim Çözeltisi:

Lizozim enzimini içeren bir çözelti olup bakteri hücre duvarının parçalanmasını (lizisini) katalizler. Gram-pozitif bakterilerde oldukça başarılı şekilde çalışır.

Selülaz Çözeltisi:

Bitki hücrelerinin dış kısmında bulunan selülazdan oluşmuş duvar yapısının parçalanmasında kullanılır.

Proteinaz K Çözeltisi:

Hücre zarında ve hücre içeriğinde bulunan proteinleri keserek denatüre eder ve DNA'nın proteinden arındırılmış bir biçimde saf halde izole edilmesini kolaylaştırır. Aynı zamanda, DNaz ve RNaz enzimlerini denatüre ederek DNA ve RNA'nın stabilitesini korur.

İzolasyonda kullanılan bazı deterjanlar:

Deterjanlar, membran proteinlerini hücre membranından ayırmak amacıyla kullanılır. İçerdiği hidrofobik özelliklere sahip grupları sayesinde lipid yapılı membranın etrafını çevreler ve proteinlerin membrandan ayrışmasını sağlarlar.

SDS (Sodyum dodesil sülfat):

Güçlü iyonik bir deterjan türüdür. DNA izolasyonundaki görevi membrandaki proteinleri denatüre ederek lizis aşamasının başarısını arttırır.

NP-40 ve Triton-X100:

İyonik olmayan deterjanlardır. Membran yapısını bozarak, proteinlerin serbest hale geçmesini ve çözünür olmasını sağlar. Proteinlerin denatüre olması istenmediği durumlarda tercih edilir.

CTAB ile İzolasyon:

CTAB, bitkilerden DNA izolasyonunda kullanılan ve lipid yapılı membranı bozarak hücre lizisini gerçekleştiren katyonik bir deterjandır. Aynı zamanda, yüksek tuz konsantrasyonlarında bitki dokularında bulunan polisakkaritlerine bağlanarak, kirlilik unsuru bu molekülleri ortamdan uzaklaştırmaktadır. CTAB, Tris, NaCl ve EDTA ile birlikte bir tampon halinde hazırlanarak uygulanır.

Edward's Tamponu:

Bitkilerden DNA izolasyonunu gerçekleştirmek amacıyla kullanılır. İçerisinde 200 mM Tris (pH=8), 200 mM NaCl, 25 mM EDTA ve %0.5'lik SDS bulunur.

Fenol-Kloroform Ekstraksiyonu:

SDS gibi deterjanlarla hücre lizisi sağlandıktan sonra, membran ve hücre içi proteinleri denatüre etmek amacıyla fenol-kloroform-izoamil alkolden oluşan bir kombinasyon izolasyon ortamına ilave edilebilir. SDS'e benzer şekilde, fenol de proteinleri güçlü bir şekilde degrade ederken, izoamil alkol, santrifüj sonunda süpernatant ve organik faz olarak iki farklı sıvı fazın oluşmasına yardımcı olur. DNA kloroform içinde çözülebildiği için kloroform ile birlikte süpernatant kısımda bulunurken, kloroformda çözünemeyen protein ve diğer bileşikleri fenol ile çöktürerek (organik faz) tüpün dibine sabitlenir. DNA'yı içeren süpernatant kısın bu tüpten alınır ve yeni tüpe aktarılır. Bu tüpte DNA, standart etanol presipitasyonu (çöktürmesi) ve %70'lik etanol yıkaması ile saflaştırılabilir.

Kaynaklar:

• https://en.wikipedia.org/wiki/Lysis_buffer

• https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/bmb.20351

• https://info.gbiosciences.com/blog/bid/156468/work-of-salt-isopropanol-and-ethanol-in-dna-extraction

• https://bitesizebio.com/2839/dna-precipitation-ethanol-vs-isopropanol/#:~:text=DNA%20is%20less%20soluble%20in,soluble%2C%20even%20at%20colder%20temperatures.