Edward's Buffer ile Bitkilerden DNA İzolasyon Protokolü

Edward's Buffer, bitkilerden genomik DNA izolasyonu için kullanılan ticari olmayan bir tampondur. Bu tampon ile, bitki üreme organlarından, genç ve hızlı büyüyen dokulardan yoğun miktarda DNA izolasyonu sağlanır.

Tampon İçeriği:

a) TE/RNase A tamponu (DNA'nın uzun süre saklanması için):

​Stok solüsyon	Add (uL)	Final Konsantrasyon
1 M Tris, pH=8.0	​100	10 mM Tris, pH=8.0
1 M EDTA	10	1 mM
RNase A (5 mg/mL)	100	50 ug/mL
dH2O	9790
Final hacim	10,000

b) Edward's tamponu (DNA izolasyonu için):

Stok Solüsyon	Add (mL)	Final Konsantrasyon
1 M Tris, pH=8.0	20	200 mM Tris, pH=8.0
1 M NaCl	20	200 mM NaCl
1 M EDTA	2.5	25 mM EDTA
%20 SDS	2.5	%0.5 SDS
dH2O	55
Final hacim	100

Cihazlar:

• Mikrosantrifüj Cihazı

• Isı bloğu

• Vorteks

• Mikropipet
  

Diğer Sarf Malzemeler:

• Mikrosantrifüj tüpleri

• Plastik çubuk

• İzopropanol

• Mikropipet uçları

Not:

• DNA izolasyonu için en az 50 mg bitki örneği gerekir.

• İzopropanol'ün soğuk kullanılması gerekir.

Bitkilerden DNA İzolasyonu Protokolü:

1. 1.5 mL'lik santrifüj tüpünü örneğinizin adını yazarak etiketleyin.

2. 50 mg bitki örneğini bu tüpe aktarın.

3. Üzerine 300 uL Edward's tamponu ekleyin.

4. Plastik çubuk ile bitki dokusunu 5 dakika boyunca mümkün olduğunca küçük parçalara ayırın.

5. Tüpteki toplam hacim 1000 uL olacak şekilde Edward's tamponu ile tamamlayın.

6. Tüpü 15 sn vorteksleyin.

7. 100 derece sıcaklıktaki ısı bloğuna tüpü yerleştirin ve içindeki örneği 10 dakika kaynatın.

8. Tüpü buradan alarak 2000 rpm'de 10 dakika santrifüj edin.

9. 400 uL süpernatantı (DNA süpernatant kısımda) tüpten alarak yeni bir ependorf tüpe transfer edin.

10. Tekrar 200 rpm'de 10 dakika santrifüj edin.

11. Tekrar 400 uL süpernatantı (DNA burada) yeni bir ependorf tüpe transfer edin.

12. Eşit miktarda (400 uL) soğuk izopropanol'ü bu tüpe transfer edin.

13. 5-10 defa tüpün ağzı kapalıyken, tüpü yavaşça alt-üst edin ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

14. 14.000 rpm'de 10 dakika tüpü santrifüj edin.

15. Süpernatantı tüpten alarak uzaklaştırın ve tüpün dibindeki DNA peletini oda sıcaklığında havayla kurumaya bırakın.

16. Kuruduktan sonra peleti 100 uL TE/RNase A tamponu ile çözün.

17. DNA saflığını ve konsantrasyonunu belirleyin.

Kaynak:

Tamari, Farsad & Hinkley, Craig. (2016). Extraction of DNA from Plant Tissue: Review and Protocols. 10.1007/978-1-4939-3185-9_17.