Trizol ile RNA İzolasyonu Protokolü - Hücre Kültüründen

Hücre Kültüründen Trizol Reaktifi İle RNA İzolasyonu

Materyaller:

• Trizol reaktifi

• Soğuk PBS

• Kloroform

• İzopropanol

• %75'lik soğuk etanol

• RNaz-free su

• Steril mikrosantrifüj tüpleri

• Pipet uçları
  

Cihazlar:

• Soğutmalı mikrosantrifüj

• Isı bloğu ya da su banyosu

• Buz makinesi

RNA İzolasyon Protokolü:

1. Trizol ile RNA izolasyonunda, 100.000-10.000.000 hücreden başarılı bir protokol yürütülebilir.

2. Buz üzerinde, hücrelerin bulunduğu kültür ortamı (besiyeri) yavaşça kuyucuklardan toplanır, her bir kuyucuk 1 mL soğuk PBS çözeltisi ile yavaşça 2 kere yıkanır.

3. PBS kuyucuklardan uzaklaştırılır ve kuyucuk içerisinde 1 mL Trizol çözeltisi eklenerek pipetaj yardımıyla tüm tabana yayılır. Böylece hücrelerin tabandan ayrışması ve parçalanması sağlanır.

4. Trizol çözeltisi kuyucuklardan toplanır ve mikrosantrifüj tüpüne transfer edilerek 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir.

5. İnkübasyon bitince, tüp içerisine 250 uL kloroform eklenir ve 15 saniye boyunca güçlü bir şekilde çalkalanır. Ardından, oda sıcaklığında inkübasyon 5 dakika daha tekrarlanır.

6. Tüp, mikrosantrifüj cihazına alınarak 10.000 rpm'de, 4 derecede 5 dakika santrifüj edilir.

7. Santrifüj bittiğinde, üstte RNA'yı içeren süernatant, ortada DNA tabakası ve en altta organik faz elde edilir.Tüpü hiç sarsmadan, dikkatli bir biçimde süpernatant sıvı çekilerek yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. DNA kontaminasyonunu engellemek için bu işlem küçük hacimlerde yavaşça yapılmalıdır.
   

8. Yeni tüoe aktarılan süpernatantın üzerine 550 uL izopropanol eklenir ve birkaç kez sakince alt üst edilerek 5 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır.

9. Mikrosantrifüj cihazının maksimum rpm'inde (15.000) rpm, beklenen RNA yığınına göre 20-30 dakika arası santrifüj yapılır ve RNA'nın pelet halinde edle edilmesi sağlanır.

10. İşlem tamamlandığında süpernatant tüpten uzaklaştırılır ve tüp, buz üzerine alınarak içerisine 1 mL, %75'lik etanol aktarılır. Tüpün dibindeki RNA peleti, etanol ile dipten hafifçe sallanarak kaldırılır ve 9.500 rpm'de 5 dakika tekrar santrifüj edilir.

11. Etanolün tamamı uzaklaştırılır, peletin çevresindeki etanol kalıntılarının uzaklaşması için tüpler kapağı açık bir şekilde, mümkünse güvenlik kabini içinde kurumaya bırakılır. Burada dikkat edilecek nokta; aşırı kurutmadan kaçınılmasıdır. Çünkü kurutma süresi uzun tutulduğunda RNA'yı sonraki adımda çözmek zorlaşacaktır.

12. Son adımda, peletin miktarına göre 15-40 uL kadar RNaz-free su ile pelet çözdürülür ve RNA saflığı/konsantrasyonu belirlenir.

13. Uzun süreli kullanım için RNA stoğu -80 derecede saklanmalıdır.

Kaynak:

• Abcam. RNA isolation protocol cells in culture Bağlantı Abcam