Protein İzolasyonu için Doku Lizatlarının Hazırlanması

Doku lizatı hazırlama amacı, hayvansal dokulardan doku lizatları hazırlamak ve sonrasında bu lizatlardaki protein miktarını belirlemektir.

Hücre duvarının veya hücre zarının parçalanması ile açığa çıkan hücre içeriği lizat olarak adlandırılmaktadır. Hücrelerin bir araya gelmesi ile dokular, dokuların bir araya gelmesi ile de organlar ortaya çıkmaktadır. Elimizde fareden alınan karaciğer, böbrek gibi organlar mevcut ise, bu organlardan alınan küçük parçaları (doku örneklerini) lizis çözeltisi kullanmak suretiyle parçaladığımızda hücrelerdeki protein açığa çıkacak ve böylece o dokudaki toplam protein konsantrasyonunu tespit etmemiz mümkün olacaktır.

Daha ileri teknikler ve yöntemler kullanmak suretiyle toplam protein içerisinde istenilen bir proteinin miktarını da bulmamız mümkün olabilmektedir.

Deneyde Kullanılacak Doku ve Malzemeler:

1. Fareden alınan ve -86 derecede saklanan böbrek ve karaciğer

2. Lizis çözeltisi

3. Proteaz inhibitor tabletleri

4. Ependorf tüpleri

5. Ezme aparatı

6. Mikropipet ve pipet uçları

7. Cımbız

8. Buz

Lizis Çözeltisinin Hazırlanması

300 mM NaCl

10 mM Tris-HCl pH: 7,4

0,5 mM MgCl2

%0,5 Triton X-100

Lizis çözeltisi yukarıdaki oranlarda hazırlandıktan sonra, 10 ml lizis çözeltisi bir tüpe aktarılır ve içerisinde 1 tane proteaz inhibitor tableti atılır.

Proteaz inhibitor tableti proteinlerin parçalanmasını önlemek amacıyla lizis çözeltisi katılmaktadır.

Doku Lizatlarının Hazırlanması

1. Dokuları (fareden alınan karaciğer ve böbrek) -86 derecelik derin dondurucudan çıkardıktan sonra petri kabı içerisine alınarak buz üzerinde küçük parçalara ayırınız.

2. Doku parçalarını PBS çözeltisi ile yıkadıktan sonra her birisini ayrı ependorf tüplerine koyunuz.

3. 1 gr doku için yaklaşık 3 ml lizis çözeltisini kullanınız.

4. Doku parçasını tüpe koyduktan sonra 500 ul lizis çözeltisi ekleyiniz.

5. Ezme aparatı ile dokuyu lizis çözeltisi içerisinde ezerek homojen bir hale getiriniz.

6. Doku tamamen parçalandıktan sonra, 500 ul daha lizis çözeltisi ekleyiniz. (toplam volüm 1 ml olacak)

7. Tüpleri vorteksle karıştırıp buz içerisine yerleştiriniz.

8. Tüpleri 1 saat boyunca her 10 dakikada bir vorteksleyerek inkübe ediniz.

9. İnkübasyon sonrasında tüpleri 4 derece, 4000 rpm'de 10 dakika santrifüj ediniz.

10. Santrifüjleme işleminden sonra tüpteki süpernatantı ependorf tüplerine transfer ederek test edilinceye kadar -86 derecede saklayınız.