Protein Ekstraksiyonu Aşamaları

Günümüzde evrensel bir protein ekstraksiyonu yöntemi yoktur. Çünkü, proteinlerin elde edileceği örnekler (bitki dokusu, memeli hücresi, bakteri vs.) çeşitlilik halindedir ve bu örneklere ait dokular ve hücreler farklı karakteristiktedir. Dolayısıyla, seçilen örneğe uygun bir protein ekstraksiyonu metodu araştırmacı tarafından belirlenmelidir.

Protein Ekstraksiyonu Amaçları:

• DNA - protein etkileşimi

• Enzimatik aktivite araştırmaları

• Protein - protein etkileşimi

• Protein pürifikasyonu

• İmmünopresipitasyon

• Doku/hücre spesifik protein ekspresyonun belirlenmesi amaçlarıyla kullanılabilmektedir.

Protein Ekstraksiyonu Aşamaları:

• Hücrelerin parçalanması

• Proteinlerin çözünmesi

• Kontaminantların uzaklaştırılması

• Ölçüm

Hücrelerin Parçalanması:

Protein ekstraksiyonunun ilk adımıdır. Bu adımda hücrelerin membran ve varsa çeper yapıları parçalanarak hücre içeriği dışarı çıkarılır. Ayrıca, proteinlere zarar verebilecek proteaz enzimlerinin eleminasyonu için uygun şartlar oluşturulur. Hücrelerin parçalanması için gerekli olan yöntem kullanılan dokunun özelliğine uygun olarak seçilmelidir. Bu yöntemleri, nazik ve kaba yöntemler olarak ikiye ayırmak mümkündür.

Örneğin, bir memeli hücresi kolay parçalanabileceğinden nazik hücre parçalama yöntemlerine başvurabilmektedir. Aksine, hücre duvarı içeren bitki hücreleri ya da bakterilerle çalışılacaksa kaba yöntemlere başvurulması daha idealdir.

Nazik metodlar: osmotik lizis, dondurma-çözdürme, deterjan lizisi, enzimatik lizis...

Kaba metodlar: sonikasyon, french press, öğütme, mekanik homojenizasyon...

Ancak, bitki dokuları gibi hücre çeperi içeren yapılarla çalışıldığında kaba yöntemler tercih edilmelidir. Doku ya da hücreler tamamen parçalandıktan sonra ortamda bulunan proteinlerin yapısal olarak stabil kalabilmeleri için dikkat edilmesi gereken birkaç husus vardır:

Proteaz adı verilen protein yıkıcı enzimlerin inaktif edilmesi için:

• düşük sıcaklıklarda çalışılması

• örneklerin olduğu ortamın pH'ının bazik (pH>9) tutulması

• proteaz inhibitörlerinin ortama dahil edilmesi (proteaz inhibitör kokteyli)

• fosforile proteinlerle çalışılacaksa fosfataz inhibitörlerinin ortama dahil edilmesi önemlidir.

Proteinlerin Çözünmesi:

Başarılı bir SDS-PAGE için proteinler deterjanlar, kaotropik ajanlar, tamponlar, tuzlar gibi çeşitli materyalleri içeren solüsyonlar yardımıyla çözdürülürek SDS PAGE'ye hazır hale getirilir. Proteinler hücreden çıkarıldıklarında bir bütün halinde yumak oluşturup çökebilmektedir (protein agregasyonu). Bu durum, protein analizi yöntemlerinin başarısını direkt olarak etkilemektedir. Protein agregasyonunu engellemek adına çeşitli tampon ve solüsyonlar kullanılarak proteinlerin çözünür hale getirilmesi gerekir. Bu amaçla, deterjanlar, kaotropik ajanlar, indirgeyici ajanlar, tuzlar ve çeşitli tamponlar sıklıkla tercih edilmektedir.

Deterjanlar, proteinler arasında bulunan hidrofobik etkileşimleri bozarak etkisini göstermektedir. Hidrofobik etkileşimler proteinlerin çözünürlüğünü engellediğinden, protein ekstraksiyonu çalışmlarında çeşitli deterjanlar tercih edilmektedir. Örnek: NP-40, Triton X, SDS...

İndirgeyici ajanlar, proteinler arasında oluşan disülfit bağlarını parçalayarak çözünürlüğü arttırmaktadır. Örnek: 2-merkaptoetanol ve DTT...

Kaotropik ajanlar, proteinler arasında bulunan hidrojen bağlarını ve hidrofobik etkileşimleri engelleyerek çözünürlüğü arttırmaktadır. Örnek üre ve tiyoüre...

Tamponlar ve tuzlar, ortamın pH ve iyon konsantrasyonunu düzenleyerek protein çözünürlüğüne etki etmektedir. Proteinlerin çoğu daha yüksek pH aralıklarında çözünür hale geçmektedir. Bu amaçla en sık kullanılan tamponlardan birisi Tris-base'dir.

Kontaminantların Uzaklaştırılması:

Proteinlerin tamamen saf olarak elde edilebilmesi için ortamdaki solüsyonlar uzaklaştırılmalıdır. Bu adımda genellikle proteinler presipitasyona (çöktürme işlemine) maruz bırakılır. Proteinlerin çözdürülmesi aşamasından sonra, sıradaki deneylerde kullanılmak üzere proteinleri mümkün olduğunca saf elde edebilmek önemlidir. Örneğin; SDS-PAGE yönteminde protein örneklerinin içerisinde deterjan, tuz ya da farklı kontaminantların bulunması deney verimini olumsuz yönde etkileyebilmektedir. Kontaminantların proteinlerden uzaklaştırılması için genellikle protein presipitasyonu (çöktürme) veya kromatografi gibi yöntemler tercih edilir.

Ölçüm:

Örneklerden toplanan proteinlerin konsantrasyon ölçümleri spektrofotometrik analizlerle gerçekleştirilir ve belirli konsantrasyonda protein örneği SDS-PAGE için hazır hale getirilir. Son aşamada, elde edilen proteinlerin varlığının ve konsantrasyonlarının belirlenmesi için çeşitli analizlere başvurulmaktadır. Proteinlerin varlığı genellikle kolorimetrik (renk değişimine dayalı) yöntemlerle test edilir. Konsantrasyon ölçümleri ise konsantrasyonu önceden bilinen bir protein örneği tarafından oluşturulan standart eğri grafiğiyle hesaplanmaktadır. Bu eğri oluşturulurken spektrofotometrik ölçümler yapılmalıdır. Sık kullanılan kolorimetrik yöntemlere Bradford ve BCA yöntemi örnek verilebilir.