Trizol Nedir? Neden Kullanılır? RNA İzolasyonunda Kullanılan Kimyasallar

RNA İzolasyonunda Kullanılan Kimyasallar/Tamponlar:

Trizol Nedir, Neden Kullanılır?

Trizol, insan, hayvan bitki, maya ya da bakteri hücrelerinden 1 saat içerisinde yüksek kalitede total RNA, DNA ve protein izole etmek için kullanılan bir reaktiftir. Trizol içeriğinde fenol, guanidin izotiyosiyonat ve izolasyonu kolaylaştıracak bazı kimyasalları içermektedir. Hücre membranını parçalamanın yanı sıra, RNA izolasyonunda kullanıldığında, ortamdaki RNaz'ları inhibe edecek bileşenlere sahiptir. Trizol, kloroform ile birlikte, hücreleri içeren homojenatı, RNA'nın (süpernatant), DNA'nın (ara faz), ve kırmızı renkli organik tabakanın olduğu üç farklı faza ayrıştırmaktadır. Süpernatant içerisinde bulunan RNA ise izopropanol yardımıyla çöktürülür. İzole edilen RNA, RT-PCR, Norther Blot analizi, Dot Blot hibridizasyonu, poly(A) seleksiyonu, in vitro translasyon, RNaz protection assay ve moleküler klonlama gibi yöntemlerde kolaylıkla kullanılabilir.

Guanidin İzotiyosiyonat:

Proteinleri güçlü bir şekilde denatüre eden bir kaotropik ajandır. Ayrıca, RNaz inhibitörlerinden RNA'yı korumaktadır.

Fenol:

Apolar bir molekül olan fenol, proteinlerin denatürasyonunu sağlarken, polar özellikli RNA ve DNA'nın çözünmesine etki etmez ve izolasyon sırasında RNA, DNA ve organik tabakanın elde edilmesini kolaylaştırır. Apolar olmasının yanı sıra, öz kütlesi (yoğunluğu) fazla olduğundan, diğer kimyasallardan önce tüpün tabanına yerleşmektedir.

Kloroform:

Güçlü bir protein denatüre edicisidir. Aynı zamanda, RNA izolasyonunda fenol içeriğinden bağımsız bir tabaka oluşturarak DNA, RNA ve organik fazlarının ayrı bir şekilde elde edilmesini kolaylaştırır.

İzopropanol:

Nükleik asitlerin alkol içerisindeki çözünürlüğü düşük olduğundan, saf izopropanol, RNA presipitasyonunda (çöktürmesinde) kullanılır. Süpernatant üzerine uygulandığında, santifüj işleminin ardından, RNA'nın pelet halinde elde edilmesini sağlamaktadır. Ayrıca, alkol de çözünebilen diğer safsızlıkların uzaklaştırılmasını kolaylaştırır.

%75'lik Etanol:

İzopropanol presipitasyonu sonrasında, pelet halinde elde edilen RNA'nın yıkanması amacıyla kullanılır. İçerisinde %25 oranında su bulunduğundan, RNA çevresindeki tuzlar/kaotropik ajanlar çözünerek uzaklaştırılır ve RNA saflığı arttırılır. Ek bir santrifüj aşamasıyla RNA pelet halinde tekrar elde edilir.

RNaz-free Su:

RNaz içermeyen ve pelet halindeki RNA'nın çözünerek homojen hale getirilmesinde kullanılan bileşendir. RNA, suda çözündükten sonra -80 derecede saklanmalıdır.

Kaynak:

• Termofisher. Trizol reagent.pdf: Bağlantı Termofisher

• Wikipedia. Phenol ectraction: Bağlantı Wikipedia